徐晨 孙婕 朱成容 阚鸿 董凯

1（吉林农业大学中药材学院，长春130118）

2（长春工业大学化学工程学院，长春 130012）

3（吉林农业大学，人参新品种选育与开发国家地方联合工程研究中心，长春 130118）

磁共振成像（MRI）具有出众的软组织对比度，目前已经成为临床应用中一种功能强大的诊断工具，被广泛应用于多种疾病的非侵入性诊断。与其它成像方式相比，MRI 可以提供丰富的解剖学信息，并且不具有电离辐射，但其敏感性较低，因此临床应用磁共振进行诊断时通常需要借助造影剂突出特定感兴趣区域（ROI）的解剖学和病理学特征。MRI 造影剂主要是通过缩短质子的驰豫时间增强不同组织之间以及病变组织与其周围正常组织之间信号强度的对比[1-2]。根据作用原理不同，MRI 造影剂可分为以钆（Gd）类化合物为主要研究对象的纵向弛豫型造影剂和以铁类物质为核心的横向弛豫型造影剂[3-9]。目前，临床应用较广泛的MRI 造影剂为Gd 螯合物，但有研究发现，潜在释放的游离Gd3+可能引起生物体肾细胞的纤维化[10-11]。因此，需要开发高效和安全的新型MRI 造影剂。

随着纳米科学和生物医学的迅猛发展，研究者开发了众多的钆基纳米MRI 造影剂[12-24]。与传统的小分子造影剂相比，纳米造影剂因在单位单元中含有大量原子，能够显著增强成像效果。此外，可以对纳米造影剂进行功能化修饰，延长其体内循环时间，增加靶向性，提高生物相容性。尽管钆基纳米造影剂在疾病诊断中的应用取得了一定进展，但纳米造影剂的安全性一直是研究者关注的重大课题。目前，关于稀土纳米造影剂的生物安全性评价仅体现在对细胞分化、增殖以及存活率的研究以及常规的血液学和病理学方面，通常只能在宏观层面上判断对机体的组织器官是否有损害。然而，由于纳米粒子独特的理化性质以及生物系统的复杂性，纳米粒子与机体之间的相互作用存在诸多不确定性，有些相互作用在生理生化水平很难被观察和检测到。因此，需要建立一种系统、高效、准确和灵敏的检测方法用于稀土纳米造影剂的生物安全性评价。

代谢组学是通过考察生物体系受刺激或扰动（如将某个特定的基因变异或环境变化）后代谢产物的变化或其随时间的变化，用于研究生物体系代谢途径的技术[25]。代谢组学融合了现代分析技术、生物信息学、化学计量学和统计学等方向，具有整体性和动态性的特点，是研究物质和机体相互作用分子机制的优良方法。近年来，研究者采用代谢组学的方法研究了纳米粒子的生物安全性，以探究纳米粒子对机体代谢途径的影响，发现标志物，确定靶点，探索其毒性机制等[26-30]。但是，采用代谢组学方法对稀土纳米造影剂生物安全性的研究目前尚未见报道。

本研究构建了聚乙二醇（PEG）修饰的四氟化钆钠（NaGdF4）纳米粒子（PEG-NaGdF4）作为钆基纳米造影剂，考察了不同剂量PEG-NaGdF4的MRI 成像能力，应用基于液相色谱-质谱联用技术的代谢组学方法对给予不同剂量的PEG-NaGdF4后的大鼠体内代谢相关物质变化进行了分析，确定PEG-NaGdF4纳米造影剂对机体影响的潜在生物标志物及代谢通路，并系统考察了机体代谢变化与PEG-NaGdF4剂量的相互关系。本研究结果表明，中剂量的PEG-NaGdF4纳米造影剂（50 μg/mL）对大鼠代谢的影响较小，说明其具有良好的生物安全性。本研究为评价稀土纳米造影剂的生物安全性提供了新策略。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

FEI Tecnai G2 F20 透射电子显微镜（荷兰FEI 公司）；Nicolet iS10 傅里叶变换红外光谱仪（美国Thermo公司）；SDT-Q600 同步热分析仪（美国Perkin Elmer 公司）；Philips Intera 1.5 T 磁共振成像系统（荷兰Best 公司）；Waters Synapt G2 UPLC-ESI-QTOF/MS（美国Waters 公司）；Milli-Q 超纯水系统（美国Millipore公司）。

聚乙二醇（PEG-2000）、乙二醇（EG）、GdCl36H2O、NH4F 和NaCl（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；乙腈和甲酸（色谱纯，美国Fisher 公司）。其它试剂均为分析纯；实验用水为超纯水（18.2 MΩ·cm）。

1.2 实验方法

1.2.1 PEG-NaGdF4的合成

称取1.5 g PEG-2000，在搅拌下溶解于20 mL 乙二醇中，将GdCl3·6H2O（0.372 g）和NaCl（0.058 g）加入到上述溶液中，在搅拌下反应30 min。将溶解有0.15 g NH4F 的乙二醇（10 mL）加入到上述溶液中，继续搅拌反应30 min，反应后的混合物移入水热反应釜中，在190 ℃反应24 h。产物离心（10 min，12000 r/min），收集固体物质，用水洗涤后再次离心，如此重复3～5 次，获得的产物置于60 ℃鼓风干燥箱中干燥。

1.2.2 MRI成像研究

采用生理盐水配制0、6.25、12.5、25、50、100 和200 μg/mL 的PEG-NaGdF4纳米造影剂溶液，置于MRI 系统对其进行扫描，评价其体外MRI 成像效果。为了评价PEG-NaGdF4纳米造影剂的体内MRI成像效果，首先将昆明小鼠麻醉，然后分别尾静脉注射25、50 和100 μg/mL 的PEG-NaGdF4纳米造影剂，在MRI 系统中采集注射前后10 min 的小鼠全身的MRI 图像。MRI 成像参数为：7.62 cm（3 英寸）表面线圈；轴向T1FSE、SE 序列；重复时间TR=620 ms；回波时间TE=20.6 s；扫描视野FOV=200×200，层厚度=3.0 mm，无间隔。

1.2.3 代谢组学样品收集与制备

选取体重约为200 g 的Wistar 大鼠（购自吉林大学实验动物中心（长春））作为实验动物。相关动物实验均遵循实验动物保护和使用委员会制定的操作条例。大鼠在适应环境7 d 后被随机分为4 组：（1）健康组（HCG，n=8）注射2.0 mL 0.9%NaCl；（2）低剂量组（LG，n=7）注射2.0 mL 25 μg/mL PEG-NaGdF4纳米造影剂；（3）中剂量组（MG，n=7）注射2.0 mL 50 μg/mL PEG-NaGdF4纳米造影剂；（4）高剂量组（HG，n=6）注射2.0 mL 100 μg/mL PEG-NaGdF4纳米造影剂。处理后的大鼠放入代谢笼中，收集18 h 尿液，尿液样品经离心（10000 r/min，10 min）后，收集上清液，于–80 ℃储存。样品在UPLC-ESI-QTOF/MS 上样前，于4 ℃解冻，然后用0.22 μm 滤膜过滤。

1.2.4 色谱-质谱检测条件

色谱条件 色谱柱为Waters Acquity UPLC BEH C18柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm），流动相A 为0.1%甲酸溶液，流动相B 为乙腈。梯度洗脱：0～5 min，95%～88% A；5～8 min，88%～50% A；8～10.5 min，50%～0% A。流速为0.4 mL/min。进样量为10 μL，进样室温度为4 ℃，柱温为25 ℃。

质谱条件 质谱采集范围为m/z50～1000，离子源温度150 ℃，萃取锥电压5.0 V，锥孔气流速50 L/h。正离子模式下毛细管电压3.0 kV，锥孔电压40 V，脱溶剂气温度350 ℃，脱溶剂气流速420 L/h；负离子模式下毛细管电压2.5 kV，锥孔电压30 V，脱溶剂气温度320 ℃，脱溶剂气流速400 L/h。采用甲酸钠建立质量标准曲线，采用2 ng/mL 亮氨酸脑啡肽进行实时质量校正。

1.2.5 数据分析

采用UPLC-ESI-QTOF/MS 对大鼠尿液样品进行检测，利用Progenesis QI 软件（Waters）对获得的相关原始数据进行峰对齐、峰检测和归一化处理。通过精确分子量-保留时间和归一化后的峰面积建立数据矩阵，采用EZinfo 2.0 软件（Waters）对其进行主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLSDA）。相关生物标志物和代谢通路采用相关生物学数据库进行鉴定和分析。

2 结果与讨论

2.1 PEG-NaGdF4的理化性质表征

采用透射电子显微镜（TEM）对PEG-NaGdF4的微观形貌进行表征。如图1A 所示，制备的PEG-NaGdF4的尺寸约为100 nm。PEG-NaGdF4的红外光谱（FTIR）如图1B 所示，在3434、2855、2929、1645 和1112 cm–1处有红外吸收峰，分别归属于O—H 的伸缩振动、—CH2—的对称伸缩振动、—CH2—的不对称伸缩振动、—CH2—的剪式振动以及C—O—C 的伸缩振动，表明PEG 被成功修饰到NaGdF4表面。采用热重分析（TGA）测试对了PEG 在纳米粒子中的含量（图1C）。由TGA 测试结果计算得到PEG 约占PEG-NaGdF4总重量的1.01%。PEG-NaGdF4的X 射线多晶衍射（XRD）图如图1D 所示，通过与数据库中的JCPDS 卡片对比后得出合成的PEG-NaGdF4为立方相晶体。以上结果证明通过一锅水热法已经成功合成了PEG-NaGdF4。

图1 聚乙二醇修饰的四氟化钆钠纳米粒子（PEG-NaGdF4）的理化性质表征：（A）透射电子显微镜（TEM）图；（B）傅里叶红外（FTIR）光谱图；（C）热重分析（TGA）图；（D）X-射线衍射（XRD）图Fig.1 Characterization of polyethylene glycol-modified gadolinium sodium tetrafluoride (PEG-NaGdF4)nanoparticles: (A) Transmission electron microscopy (TEM) image;(B) Fourier transform infrared (FTIR)spectrum;(C) Thermogravimetric analysis (TGA);(D) X-ray diffraction (XRD) patterns

2.2 体内外MRI造影效果评价

近年来，基于Gd 的纳米粒子显示出MRI 信号正增强的效果[8,20]。为了验证构建的PEG-NaGdF4的MRI 成像能力，对其进行了体内外MRI 成像研究。结果显示，在0～100 μg/mL 浓度范围内，随着PEG-NaGdF4浓度增加，其T1加权MRI 信号强度逐渐增强（图2A）。当浓度增加到200 μg/mL 时，PEG-NaGdF4纳米造影剂的MRI 信号强度减弱，这可能是由T2*效应和T1饱和导致的[31-32]。结合PEG-NaGdF4的体外MRI 成像效果，选取25、50 和100 μg/mL 的PEG-NaGdF4作为低、中、高剂量，研究其体内MRI 成像效果。如图2B 所示，与注射前相比，注射PEG-NaGdF4纳米造影剂10 min 后，小鼠的MRI 成像图显示小鼠肝脏的对比度增强，并且中、高剂量组的MRI 成像效果明显高于低剂量组。以上结果表明，构建的PEG-NaGdF4具有作为MRI 造影剂的潜力。

图2 PEG-NaGdF4 纳米造影剂的MRI 成像图：（A）不同浓度的PEG-NaGdF4 体外核磁共振成像（MRI）图；（B）低、中、高剂量PEG-NaGdF4 的体内MRI 图Fig.2 Magnetic resonance imaging (MRI) of PEG-NaGdF4 nanoparticulate contrast agents: (A) In vitro MRI images of different concentrations of PEG-NaGdF4;(B) In vivo MRI images of different concentrations of PEGNaGdF4

2.3 代谢组学研究

代谢组学已经成为纳米毒理学研究的重要工具，通过分析纳米粒子对机体代谢水平的影响，为建立下游代谢物变化与信号通路变化的关系提供有效数据，并用于评价其生物安全性。为了评价构建的PEG-NaGdF4纳米造影剂的生物安全性，本研究采集了注射低、中、高剂量（25、50 和100 μg/mL）PEG-NaGdF4纳米造影剂的大鼠的尿液样本，采用基于液相色谱-质谱联用技术的代谢组学方法进行分析。首先，采用PCA 方法对健康组和低、中、高剂量给药组的大鼠尿液样本进行分析。如图3 所示，在正离子和负离子模式下，健康组（HCG）与低（LG）、中（MG）、高（HG）剂量给药组大鼠的尿液代谢轮廓均区分明显，说明PEG-NaGdF4纳米造影剂进入大鼠体内后改变了其尿液代谢物谱。此外，由PCA 得分图中各点距离可知，LG 和MG 大鼠的状态较相近。

图3 健康组（HCG）、低剂量组（LG）、中剂量组（MG）和高剂量组（HG）大鼠尿液代谢组的主成分分析（PCA）得分图：（A）正离子模式；（B）负离子模式Fig.3 Principal components analysis(PCA)score plots of rat urine metabolome in healthy control group(HCG),low-dose group(LG),moderate-dose group(MG)and high-dose group(HG):(A)Positive ion mode;(B)Negative ion mode

为了进一步筛选出潜在生物标志物，采用OPLS-DA 方法对上述各组大鼠尿液代谢组学数据进行了分析。在正离子和负离子模式下，健康组和低、中、高剂量组可以明显聚类区分（图4）；模型评价指标见表1，结果表明模型可靠、质量良好。图5 是OPLS-DA 分析获得的S-plot 图，其中每个点均代表一种化合物，距离原点越远的点，其代表的化合物对分组的影响越大，VIP 值（Variable importance in the projection）也越高，将VIP ≥1.0 且p<0.05 的代谢物作为潜在的生物标志物。

表1 OPLS-DA模型评价指标Table 1 Evaluation indexes of OPLS-DA model

图4 大鼠尿液代谢组的正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）得分图：（A）正离子和（B）负离子模式下低剂量组与健康组；（C）正离子和（D）负离子模式下中剂量组与健康组；（E）正离子和（F）负离子模式下高剂量组与健康组Fig.4 Orthogonal partial least squares discriminant analysis (OPLS-DA) score plots of rat urine metabolome:LG vs.HCG in (A) positive ion mode and (B) negative ion mode;MG vs.HCG in (C) positive ion mode and(D) negative ion mode; vs.HCG in (E) positive ion mode and (F) negative ion mode

图5 大鼠尿液代谢组的S-plot 分析结果：低剂量组和健康组在正离子模式（A）和负离子模式（B）下的S-plot；中剂量组和健康组在正离子模式（C）和负离子模式（D）下的S-plot；高剂量组和健康组在正离子模式（E）和负离子模式（F）下的S-plotFig.5 S-plots of rat urine metabolome:S-plots of OPLS-DA for LG and HCG under (A) positive ion mode and(B) negative ion mode;S-plots of OPLS-DA for MG and HCG under (C) positive ion mode and (D) negative ion mode;S-plots of OPLS-DA for HG and HCG under (E) positive ion mode and (F) negative ion mode

为了筛选出大鼠尿液中的潜在生物标志物，将精确分子量和串联质谱数据与标准品或数据库中的串联质谱数据进行对比，最终确定其结构。如电子版文后支持信息表S1 所示，在高剂量组中共筛选出15 种潜在生物标志物，其中，7 种化合物是低剂量组的潜在生物标志物，8 种化合物是中剂量组的潜在生物标志物，这些潜在生物标志物涉及苯丙氨酸代谢、能量代谢、嘌呤代谢、色氨酸代谢和脂肪酸代谢等代谢通路。

对甲酚是苯丙氨酸和酪氨酸经肠道厌氧菌作用的代谢产物，被葡萄糖醛酸化和硫酸化后，分别生成对甲酚葡萄糖醛酸和对甲酚硫酸盐。有研究表明，对甲酚硫酸盐会引起内皮损伤并产生炎症反应[33-34]。由电子版文后支持信息表S1 可知，注射不同剂量的PEG-NaGdF4纳米造影剂后，大鼠尿液中对甲酚葡萄糖醛酸和对甲酚硫酸盐含量均有所升高，表明PEG-NaGdF4纳米造影剂会使大鼠的苯丙氨酸代谢发生扰动。

三羧酸循环是生物体内普遍存在的代谢途径，又称柠檬酸循环。该循环可为生物体提供能量，涉及机体的能量代谢。由电子版文后支持信息表S1 可知，注射不同剂量的PEG-NaGdF4纳米造影剂后，大鼠尿液中柠檬酸含量均有所下降，表明PEG-NaGdF4纳米造影剂使大鼠能量代谢发生扰动。

在嘌呤代谢过程中，尿酸是代谢产物。尿囊素在大鼠体内可由尿酸酶催化氧化尿酸产生。由电子版文后支持信息表S1 可知，高剂量组尿酸和尿囊素含量异常升高，而在低剂量组和中剂量组中无嘌呤代谢异常，表明高剂量组中大鼠嘌呤代谢发生扰动。

电子版文后支持信息表S1 中的生物标志物吲哚-3-羧酸、吲哚-3-羧酸-葡萄糖醛酸、3-羟基邻氨基苯甲酸、硫酸吲哚酚及犬尿酸均属于色氨酸的代谢产物，涉及色氨酸代谢通路，这些化合物的含量增加表明色氨酸分解增多。有研究表明，体内存在炎症反应时色氨酸消耗增加[35]。本研究中，硫酸吲哚酚、犬尿酸及吲哚-3-羧酸-葡萄糖醛酸在低剂量组中含量增加。中剂量组中，除了上述3 种生物标志物含量增加外，吲哚-3-羧酸的含量也升高。注射高剂量的PEG-NaGdF4纳米造影剂后，大鼠体内的5 种生物标志物含量均增加。上述结果表明，注射低、中、高剂量的PEG-NaGdF4纳米造影剂后，会引发大鼠机体不同程度的炎症反应，并且随着纳米造影剂剂量增加而增大。

癸二酸及壬二酸是2 种二元羧酸，涉及体内的脂肪酸代谢。在高剂量组，二者含量均升高；在中剂量组，壬二酸含量增高；在低剂量组，癸二酸含量升高。上述研究结果表明，PEG-NaGdF4纳米造影剂会引起体内脂肪酸代谢异常。

马尿酸是一类尿毒素，在体内通常由肝脏和肾脏的线粒体合成，由肾小管上皮细胞分泌排出。有研究发现尿毒症患者体内马尿酸含量增多[36]。肌酐是肌肉代谢的产物，肌肉中的肌酸主要通过不可逆的非酶脱水反应缓慢地形成肌酐。在临床检测中，肌酐用于评价肾功能，肾功能受损时肌酐含量升高。此外，12-酮基脱氧胆酸可作为肾损伤初期的标志物[37]。本研究发现，注射高剂量的PEG-NaGdF4纳米造影剂后，大鼠体内的马尿酸、肌酐和12-酮基脱氧胆酸的含量均升高，表明高剂量的PEG-NaGdF4纳米造影剂会引起一定程度的大鼠肾功能损伤。但是，在对健康组和低、中、高剂量组大鼠的肾组织切片结果分析时，并未观察到明显异常（图6），这说明在组织学检测中并未发现大鼠产生肾损伤。

图6 健康大鼠和注射不同剂量PEG-NaGdF4 纳米造影剂后的大鼠肾组织切片图Fig.6 Hematoxylin-eosin(H&E)staining images of kidneys harvested from healthy rats and rats after injection of different concentrations of PEG-NaGdF4 nanoparticulate contrast agents

上述代谢组学的研究结果表明，不同剂量的PEG-NaGdF4纳米造影剂对大鼠各个代谢通路的相关生物功能影响不同，并且呈浓度依赖性。低剂量及中剂量的PEG-NaGdF4纳米造影剂对大鼠机体代谢的影响较小，具有良好的生物安全性；高剂量的PEG-NaGdF4纳米造影剂会引起大鼠的能量代谢、脂类代谢及氨基酸代谢异常，并引发一定程度的炎症反应和肾功能损伤。

3 结论

本研究构建了基于PEG-NaGdF4的MRI 纳米造影剂，采用基于液相色谱-质谱联用的代谢组学技术分析了不同剂量的PEG-NaGdF4纳米造影剂对大鼠尿液代谢组的影响，最终对其生物安全性进行了评价。通过对各代谢组实验数据进行分析，在低、中、高剂量组中分别鉴别出7、8 和15 种潜在生物标志物。进一步对相关代谢通路进行分析，发现不同剂量的PEG-NaGdF4纳米造影剂对大鼠代谢的影响不同。其中，低和中剂量的PEG-NaGdF4纳米造影剂对各个代谢通路的相关生物功能影响较小；高剂量的纳米造影剂会在短时间内引起机体一定程度的炎症和肾损伤。MRI 成像及代谢组学相关结果表明，中剂量的PEG-NaGdF4纳米造影剂有成为安全、高效的MRI 造影剂的潜能，有望用于临床医学检测。

支持信息

Supporting Information

表S1 PEG-NaGdF4 纳米造影剂对大鼠尿液代谢影响的潜在生物标志物TableS1 Potential biomarkers of urine metabolites induced by PEG-NaGdF4 nanoparticulate contrast agents