王叶盛 于春淼 李艳茹 李冰凌*

1（中国科学院长春应用化学研究所，电分析化学国家重点实验室，长春 130022）

2（中国科学技术大学应用化学与工程学院，合肥 230026）

纳米孔技术是一种具有广阔前景的单分子技术，可对蛋白质、核酸及聚合物等多种分子进行高灵敏度、高通量以及免标记分析[1-11]。在直径为纳米级别的孔道两端施加一定的电压时，会产生稳定的电流，当尺寸与孔径相近的单个待测分子穿过孔道时，会产生阻塞效应，进而产生一个瞬时的电流改变[12]。通过对阻塞时间、阻塞电流强度、阻塞频率以及阻塞电流形状等进行分析，有望得到待测物的长度、尺寸、浓度以及结构等方面的相关信息。纳米孔通常分为由蛋白质构成的生物纳米孔[13-16]与由无机或有机材料制成的固相纳米孔[17-20]两类。生物纳米孔作为最新一代测序方法，已被广泛应用于DNA 测序[2]，但其相对较小的孔径（通常小于5 nm）限制了检测对象的范围。相比之下，固相纳米孔具有更高的化学/机械稳定性和尺寸可控性，并可以在相对宽松的环境（pH、温度和离子强度）下进行长时间稳定的信号读出，但较差的分辨率与制备重现性限制了其应用，特别对于尺寸远小于固相孔孔径的分子（如短链核酸等）时，无法满足检测的要求。

在本研究组前期的工作中，通过向纳米孔电解质中加入具有高介电常数的溶剂甲酰胺，使纳米孔的低频电噪声降低了约3 个数量级，并首次使用无修饰的锥形玻璃裸孔对催化发夹自组装反应（Catalytic hairpin assembly，CHA）进行了原位跟踪[21]。基于该增敏策略，可使用固相纳米孔检测到低至59 nt 的DNA 发夹结构。但是，受孔径因素的制约，在对100 bp 左右的CHA 单体产物进行表征时，仍可能存在事件（Event）捕获量较低的缺陷[22]。同时，甲酰胺对于蛋白质和RNA 等具有一定的破坏性，这也在一定程度上限制了该策略检测的靶标范围。另外，通过对核酸分子线路的设计进行优化，已经能得到可控的单体[21]以及尺寸与聚合度可控的1～4 聚体[22]，但在单体表征方面，仍可能无法产生满意的、可重复的放大效应，需开发相应的解决方案。

本课题组在前期工作中利用分裂模式G-四链体结构放大杂交链式反应（Hybridization chain reaction，HCR）纳米孔信号[23]，基于此，本研究以CHA 单体为模型，加入一条新的富G 短链与其结合，在组装体的尾端形成了分裂模式的G-四链体。此结构增加了组装体的易位体积，可将组装体的易位电流放大2～3 倍，并在未加入甲酰胺的条件下，对反应单体的易位事件进行了稳定捕捉。不同于之前工作中的分裂G-四链体形成模式，即在底物发夹5′端或3′端添加分裂模式的G-四链体序列[23]，本研究在原有序列的基础上，将其中单一反应底物的3′端延长约10 nt，并基于单体结构设计了一条富G 短链与其结合。基于富G 短链与结合位点设计的可编辑性，本方法具有灵活性与普适性。同时，本方法无需加入甲酰胺，因此有望拓展检测靶标范围。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

DS-11 FX+分光光度计（美国DeNovix 公司）；FlexCycler2多功能PCR 仪（德国耶拿分析仪器股份公司）；Axon Axopatch 200B 膜片钳放大器、Axon Digidata 1550B 数模转换器（美国MD 公司）；SUTTER P-2000 激光微电极拉制器（美国Sutter Instrument 公司）。

甲酰胺、LiCl（Sigma-Aldrich（上海）贸易有限公司）。除非另有说明，本研究使用的试剂均为分析纯。CHA 缓冲液（pH=8.0）:20 mmol/L Tris-HCl、140 mmol/L NaCl、2.5 mmol/L MgCl2。所有寡核苷酸序列均由上海生工有限公司合成，并在初次使用前使用PAGE 纯化，其序列如表1 所示。所有寡核苷酸均溶解在1 × TE 缓冲液中（10 mmol/L Tris-HCL,l mmol/L EDTA,pH=7.5）中，于‒20 ℃储存。

表1 实验中使用的DNA序列Table 1 Sequences of DNA primers used in the experiment

1.2 实验方法

1.2.1 玻璃锥形纳米孔的制备与表征

玻璃锥形纳米孔由石英玻璃管（外径1 mm，内径0.7 mm，美国Sutter Instrument 公司）拉制而成，在使用前将玻璃管在现制的食人鱼溶液（98% H2SO4/30% H2O2，3∶1，V/V）中浸泡约1.5 h，以除去其表面的有机杂质。使用去离子水将玻璃管冲洗干净，置于丙酮中超声20 min，置于丙酮中保存。在采集纳米孔信号前，将玻璃管置于真空干燥箱中，于70 ℃下干燥20 min，使用P-2000 移液管拉制器拉制纳米孔，备用。本研究中使用的所有纳米孔均使用同一拉制参数：HEAT=760，FIL=4，VEL=31，DEL=120，PUL=170。

1.2.2 纳米孔数据的采集与分析

所有纳米孔数据的采集均在实验室自行设计与搭建的纳米孔测试平台[21-23]上进行。在进行DNA 易位实验前，样品溶液被注入纳米孔尖端外侧的玻璃样品池（cis端），向玻璃锥形纳米孔（trans端）中注入与样品池中溶液离子强度一致的电解质溶液，并排出孔中气泡，确保电解质溶液完全注入纳米孔孔尖。在样品池和孔内腔中分别放置2 个氯化银电极，用于施加电位。在采集纳米孔数据时，在纳米孔两端施加600 mV 的恒电位，从而驱动样品池中的DNA 样品定向穿孔。离子电流由Axopatch 200B 电流放大器采集，使用5 kHz 的低通Bassel 滤波器，并使用Digidata 1550B 数字化仪以250 kHz 的采样频率进行数字化。使用Clampfit 11.2 软件对电流信号进行处理，根据阈值收集易位数据，其中，最小电流幅度水平为20 pA，最小易位时间为0.02 ms。所有实验均在室温（25 ℃）下进行。

1.2.3 三通催化发夹自组装反应

选择三通催化发夹自组装反应（3-way catalytic hairpin assembly reaction，3w-CHA reaction）为模板进行实验。实验开始前，将C1、H1、H2 和H3 的储备液在CHA 缓冲液中稀释至5 μmol/L，在95 ℃下孵育5 min，以0.1 ℃/s 的变温速度降温至25 ℃。在40 μL CHA 反应体系中，C1 的最终浓度为0.025 μmol/L，H1、H2 和H3 的最终浓度为0.25 μmol/L，并加入终浓度为40 mmol/L 的KCl 溶液。25 ℃下孵育反应3 h。反应结束后，取5 μL 反应产物与2 μL 上样缓冲液混合，采用2.5%琼脂糖凝胶进行电泳，每毫升琼脂糖凝胶含有0.07 μL Gel Red 染料。电泳在1×TAE 缓冲液中进行，在120 V 电压下运行35 min 后，在紫外灯下对核酸条带进行观察。另取20 μL 反应产物，与10 μL 甲酰胺（100%）和20 μL 10 mol/L LiCl 混合，制成样品溶液，采用纳米孔表征。

1.2.4 附加分裂模式G-四链体的催化发夹自组装反应

在1.2.3 节的反应体系中，增加一条S 链，其浓度与加入体积均与H2 相同。在40 μL CHA 反应体系中，S 的最终浓度为0.25 μmol/L。在K+的对比实验中，在反应开始2 h 后，向对应的反应体系中补充KCl溶液，使K+的终浓度为40 mmol/L，无K+的反应体系则补充等体积的CHA 缓冲液，并继续反应1 h，使反应总时间为3 h。电泳与纳米孔样品的配制均与1.2.3 节相同。

1.2.5 附加完整G-四链体的催化发夹自组装反应

在H2 的3′端加添加完整的G-四链体序列（GGGTGGGTGGGTGGGT，T30695），得到新的H2 发夹（H2-G）。与1.2.4 节的实验相比，将H2 替换为等体积与浓度的H2-G，并移除加入的S 链。其余步骤与1.2.4节相同。

1.2.6 荧光共振能量转移表征

在荧光共振能量转移表征中，新加入F 和Q，并使用H3-FQ 替换H3。在反应开始前，将浓度相同的F 和Q 按体积比3∶4 混合，在95 ℃下孵育5 min，以0.1 ℃/s 的变温速度降温至25 ℃，备用，其它步骤与1.2.3～1.2.5 节对应的反应前准备步骤相同。在终体积为40 μL 的CHA 反应体系中，C1（若存在）的终浓度为0.01 μmol/L，H1、H2（H2-G）、H3-FQ 和S（若存在）的终浓度均为0.10 μmol/L，F 的终浓度为0.15 μmol/L，Q 的终浓度为0.20 μmol/L，并加入终浓度为2 μmol/L 的dT21，防止荧光吸附造成读数损失。将反应体系混合均匀，立刻取17 μL 产物于Cytation-5 全自动微孔板检测器（美国Bio Tek Instrument）中，在25℃条件下，每1.5 min 进行一次读数。

1.2.7 原卟啉(Protoporphyrin IX,PPIX)荧光表征

使用PPIX 荧光验证是否形成G-四链体结构。在反应开始2 h 后，向反应体系中加入终浓度为0.5 μmol/L 的PPIX 溶液，并继续反应1 h。反应结束后，取17 μL 产物于全自动微孔板检测器中，在25 ℃、410 nm 的激发波长下，记录580～660 nm 的荧光发射光谱。

2 结果与讨论

2.1 催化发夹自组装反应的原理以及附加G-四链体的催化发夹自组装反应的设计

本研究的基础是产物为三叉（也称三臂）结构的CHA 反应，简称3w-CHA 反应。该反应涉及3 个发夹底物H1、H2 与H3，彼此之间存在部分互补的序列，但受动力学势阱的制约，相互之间的杂交反应被严重抑制。如图1A 所示，当存在长度为24 nt 的引发剂C1 时，1*结构域与发夹底物H1 的1 结构域杂交，启动一个基于立足点迁移的链置换反应，进而将发夹底物H1 的茎打开，释放出3*结构域；基于同样的原理，3*结构域与发夹底物H2 的3 结构域结合后，可将发夹底物H2 的茎打开，释放出4 结构域；4 结构域与发夹底物H3 的4*结构域结合后，可将发夹底物H3 的茎打开，最终形成H1·H2·H3 结构，并将C1释放回溶液中，继续进行催化反应[24，25]。如图1B 所示，在底物发夹H2 被打开后，S 链的5*与8*结构域可与H2 的5、8 结构域杂交，并在H2 与S 链连接端的外侧保留a 与b 两个结构域。当存在一定浓度的K+时，a 与b 两个结构域可形成3∶9 分裂模式的G-四链体结构。如图1C 所示，将3w-CHA 中的H2 替换为H2-G 后，通过CHA 反应，可得到反应产物H1·H2-G·H3。当存在一定浓度的K+时，其结构域c 可自身形成G-四链体结构。在下文中，将附加分裂模式G-四链体序列的催化发夹自组装反应产物（3w-CHA with split G-quadruplex tail）简称为sG4-CHA，该反应简称为sG4-CHA 反应；对于附加完整G-四链体序列的催化发夹自组装反应产物（3w-CHA with full G-quadruplex tail）称为G4-CHA，该反应简称为G4-CHA 反应。将加入了C1 的反应体系作为反应组，未加入C1 的反应体系作为对照组。

图1 3 种催化发夹自组装（CHA）反应的原理示意图：（A）3w-CHA 反应；（B）sG4-CHA 反应；（C）G4-CHA 反应Fig.1 Schematic diagram of three kinds of catalytic hairpin assembly(CHA)reactions: (A)3w-CHA reaction;(B)sG4-CHA reaction;(C)G4-CHA reaction

2.2 3w-CHA、G4-CHA以及sG4-CHA的电泳与荧光表征

首先采用凝胶电泳和荧光共振能量转移两种方式对2.1 节中的3 种CHA 反应进行了表征。由图2A的电泳条带可见，3w-CHA、G4-CHA 与sG4-CHA 在有无C1 加入时区分明显，可以由此判断C1 的确对反应具有驱动作用。荧光共振能量转移的检测方式如图2B 所示，当未发生CHA 反应时，H3-FG 的结构域“7”被包埋在发夹的茎中；发生反应后，结构域“7”被释放，在溶液中可与F-Q 形成的Reporter 双链体（Reporter duplex）发生基于立足点迁移的链迁移反应，将标记有猝灭基团的探针Q 从双链体上置换，并产生可被检测到的荧光信号。分析图2C 的荧光动力学曲线可知，对于3w-CHA、G4-CHA 与sG4-CHA反应，在K+不存在时，反应组均展现出远快于对照组的荧光增强速度，进一步验证了C1 对于CHA 反应的驱动（催化）作用。并且G4-CHA 与sG4-CHA 反应组的产物电泳条带深度和荧光增强速度均与3w-CHA 非常相近，说明替换H2 或引入S 链后，并不会对CHA 反应产生负面影响。值得注意的是，在不含K+的反应体系下，G-四链体结构的形成趋势较弱，因此，同时考察了K+对于G-四链体结构形成的影响。由图2A 可见，K+加入与否，电泳条带几乎没有区别，因此仅从电泳图上无法判断是否形成了G-四链体结构。为了验证G4-CHA 与sG4-CHA 两种反应是否能够按照预期设计形成G-四链体结构，利用PPIX荧光法验证G-四链体结构的形成，其原理图如图2D 所示，PPIX 在水溶液中通常聚集成低荧光背景的胶束，与G-四链体结合后，其荧光强度显著增强。对比了K+存在与否时G4-CHA 与sG4-CHA 反应的反应组，结果如图2E 所示。因为H2-G 自身具有完整的G-四链体序列，在较高浓度一价阳离子（Na+）存在下，也会诱导形成一部分G-四链体结构[26]，所以G4-CHA 的两组PPIX 信号相差不大。sG4-CHA 的PPIX 信号较弱，加入K+后，信号较强，表明随着K+的加入形成了分裂模式的G-四链体结构。K+存在时，sG4-CHA的PPIX 信号强度低于G4-CHA，这是由于分裂模式的结构变化导致的[27]。

图2 3w-CHA、G4-CHA 以及sG4-CHA 的电泳与荧光表征：（A）3w-CHA、G4-CHA 以及sG4-CHA 的琼脂糖凝胶电泳表征；（B）荧光动力学原理示意图；（C）3w-CHA、G4-CHA 以及sG4-CHA 的荧光动力学表征；（D）原卟啉（PPIX）荧光原理示意图；（E）G4-CHA 与sG4-CHA 的PPIX 荧光表征Fig.2 Electrophoretic and fluorescence characterization of 3w-CHA,G4-CHA and sG4-CHA;(A)Agarose gel electrophoresis characterization of 3w-CHA,G4-CHA and sG4-CHA;(B)Schematic diagram of fluorescence dynamics;(C)Fluorescence characterization of 3w-CHA,G4-CHA and sG4-CHA;(D)Schematic diagram of protoporphyin IX (PPIX) fluorescence;(E)PPIX fluorescence characterization of G4-CHA and sG4-CHA

2.3 3w-CHA、G4-CHA以及sG4-CHA的纳米孔表征

利用固相纳米孔对3w-CHA、G4-CHA 以及sG4-CHA 进行了表征。固相纳米孔的装置如图3A 所示。对于3w-CHA，截取基线电流与部分原始电流，对300 s 的原始电流进行统计后，绘制穿孔电流与穿孔时间的散点图（图3B），反应组与对照组的事件量与分布相差较明显；对相应的穿孔电流进行统计，绘制其绝对值的分布图（图3C），反应组的穿孔电流集中在‒40 pA 附近，相比对照组的电流分布为5～10 pA，这也与本研究组此前的研究结果基本吻合[21-22]。

图3 3w-CHA 的纳米孔表征：（A）纳米孔装置的示意图；（B）3w-CHA 对照组与反应组的原始电流以及穿孔电流与穿孔时间的散点统计图；（C）3w-CHA 对照组与反应组的穿孔电流绝对值的分布图。所有数据均由同一纳米孔测得Fig.3 Nanopore characterization of 3w-CHA: (A)Schematic diagram of the nanopore set-up;(B)The current traces and the scatter statistics of the amplitude and duration time of 3w-CHA;(C)Distribution of absolute of amplitude of 3w-CHA.All the data are measured with the same nanopore

对于G4-CHA 及sG4-CHA，分别对不存在C1 与K+、仅存在C1、仅存在K+以及同时存在C1 与K+这4 种条件下的产物进行了纳米孔表征。对于G4-CHA，分别截取相应的原始电流（图4A），绘制了对应的散点图（图4B），不存在K+时，G4-CHA 的反应组与对照组的事件量相差明显；统计对应的穿孔电流，绘制了绝对值的分布图（图4C），相较于对照组，反应组的穿孔电流有较大偏移，在–50～–100 pA 的范围内存在较多事件。发生电流偏移的原因可能是H2-G 的G-四链体序列在Na+影响下形成了部分G-四链体结构，刚性的G-四链体会增加组装体的相对体积，从而增加穿孔电流。K+存在时，反应组与对照组的事件量相差明显，并且反应组存在明显的电流偏移，在–50～–150 pA 范围内存在较多事件。此时，事件数的差异与电流偏移均可归结于G4-CHA 反应的进行程度不同。

图4 G4-CHA 与sG4-CHA 的纳米孔表征：（A）不同条件下G4-CHA 的部分原始电流;（B）不同条件下G4-CHA 的穿孔电流与穿孔时间的散点统计图;（C）不同条件下G4-CHA 的穿孔电流绝对值的分布图;（D）不同条件下sG4-CHA 的部分原始电流;（E）不同条件下sG4-CHA 的穿孔电流与穿孔时间的散点统计图;（F）不同条件下sG4-CHA 的穿孔电流绝对值的分布图。所有数据均由同一纳米孔测得Fig.4 Nanopore characterization of G4-CHA and sG4-CHA: (A) Current traces of G4-CHA under different conditions;(B) Scatter statistics of amplitude and duration time of G4-CHA under different conditions;(C) The distribution of absolute of amplitude of G4-CHA under different conditions;(D) Current traces of sG4-CHA under different conditions;(E) Scatter statistics of amplitude and duration time of sG4-CHA under different conditions;(F)The distribution of absolute of amplitude of sG4-CHA under different conditions.All the data are measured with the same nanopore

对于sG4-CHA，分别截取相应的原始电流（图4D），绘制了对应的散点图（图4E），不存在K+时，sG4-CHA 的反应组与对照组的事件量相差明显，此时即可判断反应是否发生；统计对应的穿孔电流，并绘制了绝对值的分布图（图4F），其穿孔电流集中在‒50 pA 附近，相较于3w-CHA，sG4-CHA 的穿孔电流整体有增大的趋势，这是由于结合了S 链的sG4-CHA 尺寸略有增加。存在K+时，sG4-CHA 的对照组与反应组相较于不存在K+时均有较大的电流偏移且事件数增加。事件数增加主要来自G-四链体带来的结构放大效应，电流偏移则来自分裂模式形成的G-四链体。相较于背景组，反应组在–100～–150 pA 范围内存在更多的穿孔事件，整体的电流分布也明显偏移。两者的分布图差异较明显，可以判断反应是否发生。

综上，与3w-CHA 反应相比，G4-CHA 反应与sG4-CHA 反应在K+的调控下，均能实现较大的信号增敏。即使在不加入K+时，G4-CHA 与sG4-CHA 的反应组与对照组的电流分布区分明显。同时，对于不加入C1 的对照组，加入K+也能实现信号放大。相较于sG4-CHA，G4-CHA 在不加入K+时也具有一定的背景，而sG4-CHA 在不存在与存在K+时差距明显。在底物发夹H2 未打开时，S 链与H2 只有6 个互补碱基，不足以使H2 与S 链稳定结合。发生CHA 反应后，或至少在H2 被H1 打开后，H2 与S 链存在12 个互补碱基，此时H2 与S 链才能较稳定地结合，因此sG4-CHA 对K+的调控能力更出色。同时，鉴于H2-G自身带来的高PPIX 背景，使得根据G4-CHA 反应的PPIX 荧光无法判断G-四链体结构是否在CHA 产物上形成，相较之下，由于存在一步S 链与单体产物的结合步骤，sG4-CHA 反应的PPIX 荧光大致能反映分裂模式G-四链体结构的形成数量。因此，从序列设计与多角度表征等方面考虑，选择引入表征方式相对较多、背景较低、序列灵活性较高的分裂模式G-四链体结构作为增敏方法更合适。

2.4 sG4-CHA在水相中的纳米孔表征

本研究已经验证了3∶9 分裂模式G-四链体结构的信号放大作用。为了进一步探索此设计的增敏效果，移除了电解质与样品中的降噪组分（甲酰胺），并将其替换为等体积的水，对K+存在条件下的sG4-CHA 进行了纳米孔表征。分别截取相应的原始电流（图5A），绘制对应的散点图（图5B），统计对应的穿孔电流分布，绘制其绝对值的分布图（图5C）。尽管原始电流波动较大，但仍能捕捉到sG4-CHA 的穿孔事件（电流变化幅度大于50 pA）。从事件分布较多的穿孔电流范围（–50～–150 pA）来看，反应组在各个电流区间的事件数均多于对照组，且整体电流分布相较于对照组偏移约20 pA。反应组的事件数接近于对照组的3 倍，这也与原始电流基本相符。上述结果说明固相纳米孔在水相中也能成功识别反应是否发生，即在无需加入降噪组分时，此增敏策略也能成功实现对sG4-CHA 的捕捉。

图5 在水相中sG4-CHA 的纳米孔表征：（A）sG4-CHA 的部分原始电流；（B）sG4-CHA 的穿孔电流与穿孔时间的散点统计图；（C）sG4-CHA 穿孔电流绝对值的分布图。所有数据均由同一纳米孔测得Fig.5 Nanopore characterization of the products of sG4-CHA in water: (A)Current traces of sG4-CHA;(B)Scatter plots of sG4-CHA;(C)Columnar distribution of absolute of amplitude of sG4-CHA.All the data are measured with the same nanopore

3 结论

本研究提出了一种基于G-四链体结构的纳米孔增敏策略，能增加固相纳米孔对小尺寸核酸组装体的识别与捕捉。3w-CHA 反应单体附加完整模式或分裂模式的G-四链体序列后，均可通过控制G-四链体结构的形成实现纳米孔信号放大。相较于完整模式的G-四链体结构，分裂模式的G-四链体结构具有更低的背景与更高的序列设计灵活性。本方法仅需对3w-CHA 反应中单个底物略做修改，并加入一条经过设计的约20 nt 的短链，即可通过碱基互补配对在产物上附加分裂模式的G-四链体序列，通过控制G-四链体结构的形成，可将产物的穿孔电流增大约2～3 倍，借此实现对小分子组装产物的高灵敏检测。值得注意的是，在单体产物上附加分裂模式G-四链体序列后，固相纳米孔能准确捕捉与判断是否形成G-四链体，这证明固相纳米孔具有分析纳米结构的动态构象的能力，也表明此结构具有作为K+特异性响应的分子机器的潜力。在移除了具有较差生物相容性的降噪组分甲酰胺后，此增敏策略同样能准确检测小分子核酸组装体，这有利于靶标范围向RNA 等方向拓展。未来，通过对纳米孔分析平台装置、纳米孔孔径等重要因素的优化，可能为更小的靶标检测提供基础，推动固相纳米孔在核酸分子层面的表征的发展与应用。