宋铁兵,李康乐,马 强,赵颖林,赵 军,谢 娟

(1.西安市中医医院,陕西 西安 710021;2.西安大兴医院渭水园院区,陕西 西安 710018)

乳腺癌是女性最常见恶性肿瘤,2018年全球新增病例约289万例,死亡62.6万人[1-2]。中医称乳腺癌为乳岩,发病原因为情志失调、饮食失节、冲任不调,患者在气血亏虚的同时感受毒邪之气,阻塞经络,造成气滞血瘀,日久痰核凝结,形成乳岩。目前,乳腺癌的治疗主要依靠手术、化疗、放疗、内分泌和抗体治疗[3]。三阴性乳腺癌占乳腺癌15%,由于治疗方案有限,该型患者转移率高,预后极差[4]。据清代赵学敏所编的《本草纲目拾遗》记载,古代有很多医家单独使用土贝母的块茎来治疗妇人乳痈、乳岩、痈疽及诸郁之症,现仍被广泛应用[5]。中药土贝母味苦,性微寒,归肺、脾经,有散结消毒、散痈肿的功效。近些年来大量研究表明,土贝母皂苷甲(Tubeimoside I,TBMS Ⅰ)是土贝母的主要活性成分,具有广泛抗肿瘤活性[6]。

早期生长反应因子1(Early growth response 1,Egr1)是Egr转录因子家族成员,具有高度保守的GC的含量启动子结合,Egr1受到多种细胞因子、神经递质、激素、DNA损伤因子、其他压力刺激,Egr1具有多种功能,可直接调节多种生物过程包括生长发育、细胞周期阻滞、分化、凋亡、癌症等[7]。Egr1在细胞中被抑制后,300多个基因受到影响,包括转录因子、生长因子、细胞周期蛋白调节因子、结构蛋白[8]。p21是位于Egr1下游的细胞周期素依赖性激酶抑制因子,由于p21通过短暂或永久地诱导细胞周期阻滞来抑制癌细胞增殖,被认为是一种重要的肿瘤抑制剂,另外p21还能促进细胞分化、衰老,抑制基因转录和凋亡[9]。有研究发现,p21可被上游Egr1直接激活发挥作用[10]。本次研究在Egr1/p21信号通路的基础上展开,通过土贝母皂苷甲体外干预人MCF-7细胞,探索其对人乳腺癌细胞凋亡的影响及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 细胞株:乳腺癌MCF-7细胞(货号CL-0149,武汉普诺赛生命科技有限公司)传至4～5代。

1.1.2 药品及试剂:土贝母皂苷甲(纯度≥98%,HPLC,CAS:102040-03-9);DMEM培养基(批号J180009,HyClone公司);胎牛血清(HyClone公司);青霉素-链霉素(批号15140-122,HyClone公司);胰酶0.25%(批号AD21573271,HyClone公司);CCK-8细胞增殖与毒性检测试剂盒(批号20160406);DMSO(批号300490623);引物、RNA提取试剂盒及逆转录试剂盒(批号9108)。

1.1.3 实验仪器:生物显微成像系统(Olympus公司);高速冷冻离心机(型号HC-3018R,科大创新股份有限公司);酶标仪(型号1510,Thermo公司);反转录仪(Eppendorf AG公司);qRT-PCR仪(型号Takara)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养及分组:采用90%的DMEM基础培养基、10%胎牛血清、1%双抗,三者按比例混合均匀即为完全培养基。将复苏或传代后的MCF-7细胞放置于细胞培养瓶中培养,在每个25 cm2培养瓶中加4 ml完全培养基,将细胞培养瓶放置于5%的CO2,37 ℃恒温培养箱中培养,2～3 d换1次液,待细胞对数增长时,进行实验。细胞分组:空白组、TBMS Ⅰ高剂量组、TBMS Ⅰ中剂量组、TBMS Ⅰ低剂量组。

1.2.2 土贝母皂苷甲溶液配制:精确称量土贝母皂苷甲固体粉末3.20 mg,溶于20 ml完全培养基中,震荡使完全溶解,得160 μg/ml的土贝母皂苷甲母液,放于冰箱4 ℃保存,备用。TBMS Ⅰ高剂量组浓度20 μg/ml、TBMS Ⅰ中剂量组浓度15 μg/ml、TBMS Ⅰ低剂量组浓度10 μg/ml。

1.2.3 细胞增殖检测:取对数生长期的MCF-7细胞接种到96孔培养板上,每孔5×103个细胞,边缘孔加入PBS溶液,防止实验培养基挥发影响结果,每个实验组设3个复孔,将96孔培养板放入细胞培养箱孵育24 h,待细胞贴壁后,使用不同浓度的土贝母皂苷甲干预细胞24 h,之后每个实验孔加入20 μl的CCK-8试剂,继续在培养箱中孵育4 h,使用酶标仪在450 nm波长下检测OD值,根据OD值计算细胞存活率。重复上述步骤,药物干预时间分别改为48 h和72 h,最后计算出对应干预时间的细胞存活率。

1.2.4 流式细胞仪检测细胞凋亡:取对数生长期MCF-7细胞接种于6孔板,每孔5×105个细胞,将6孔板放入细胞培养箱孵育24 h,待细胞贴壁后,使用不同浓度的土贝母皂苷甲干预细胞48 h,之后收集培养基中的细胞,使用PBS溶液洗涤2次,消化,离心1000 r/min、5 min,对应收集细胞,加入400 μl 1×Binding Buffer将2次收集的细胞制备成细胞悬液;向细胞悬液中加入5 μl的Annexin V-FITC,轻轻混匀,室温条件,避光孵育15 min,再向其中加入10 μl的PI染色剂,混匀,避光冰浴5 min,在0.5 h内用流式细胞仪进行凋亡检测。

1.2.5 流式细胞仪检测细胞周期分布:取对数生长期MCF-7细胞接种于6孔板,每孔1×106个细胞,将6孔板放入细胞培养箱孵育24 h,待细胞贴壁后,使用不同浓度的土贝母皂苷甲干预细胞48 h,之后使用PBS溶液洗涤2次,消化,离心1000 r/min、5 min,收集细胞,使用PBS溶液将细胞浓度调整为1×106个/ml,取浓度为1×106个/ml的细胞悬液1 ml,离心2000 r/min、5 min,弃上清,加入500 μl的70%冷乙醇固定,4 ℃过夜,离心1000 r/min、5 min,弃冷乙醇固定液,加50 μl的RNase A 、450 μl的PI配置好的工作液,混匀,4 ℃避光放置0.5 h,用流式细胞仪检测。

1.2.6 Western blotting检测Egr1、p21蛋白表达:待细胞培养瓶里的细胞呈对数生长时,并且细胞长至70%左右时,使用不同浓度的土贝母皂苷甲干预细胞48 h,弃掉培养基,加PBS溶液洗涤2次,消化,离心2000 r/min、5 min,收集细胞,按照蛋白提取试剂盒说明书提取蛋白,随后上样每孔20 μg,电泳,转膜,封闭过夜。次日,加入一抗,室温孵育2 h,使用PBST溶液洗涤5次,加入二抗,室温孵育2 h后,避光加入ECL发光液,显影。

1.2.7 qRT-PCR检测Egr1、p21 mRNA表达:待细胞培养瓶里的细胞呈对数生长时,并且细胞长至70%左右时,使用不同浓度土贝母皂苷甲干预细胞48 h,弃掉培养基,加PBS溶液洗涤2次,消化,离心2000 r/min、5 min,收集细胞,按总RNA提取试剂盒说明书提取总RNA,使用核酸浓度测量仪测定总RNA浓度、纯度,测定结果表明样品OD260/OD280值均在1.8～2.1范围之内,符合要求。取各样品RNA 1 μg与5×Primer Script RT Master Mix、无菌无酶水组成10 μl反应体系,混匀,进行反转录。反应条件:先37 ℃、15 min,后85 ℃、反应5 s,将反转录产物cDNA放置于冰箱-20 ℃中保存备用,使用Thermal Cycler Dice Real Time System扩增仪,检测目的基因相对表达。

2 结 果

2.1 各组MCF-7细胞存活率比较 见表1。土贝母皂苷甲干预MCF-7细胞24 h后,TBMS Ⅰ高剂量组对MCF-7细胞抑制作用最明显。干预48 h后,TBMS Ⅰ高剂量组、TBMS Ⅰ中剂量组、TBMS Ⅰ低剂量组都能抑制MCF-7细胞活性。干预72 h,TBMS Ⅰ高剂量组、TBMS Ⅰ中剂量组、TBMS Ⅰ低剂量组能明显抑制MCF-7细胞存活率,与48 h组内比较差异有统计学意义(均P<0.05)。

表1 各组MCF-7细胞存活率比较(%)

2.2 各组MCF-7细胞凋亡比较 土贝母皂苷甲能够诱导MCF-7细胞凋亡,土贝母皂苷甲各剂量组与空白组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。TBMS Ⅰ低剂量组对MCF-7细胞凋亡率10.9%、TBMS Ⅰ中剂量组20.4%、TBMS Ⅰ高剂量组31.9%,提示TBMS Ⅰ高剂量组对MCF-7细胞的凋亡效果最好。

2.3 各组对MCF-7细胞周期的影响 见表2(图1)。土贝母皂苷甲干预MCF-7细胞48 h后,土贝母皂苷甲各剂量组G0/G1期细胞所占比率均减低,差异有统计学意义(P<0.05)。48 h后土贝母皂苷甲各剂量组G2/M期细胞占比均增高,差异有统计学意义(P<0.05)。

图1 各组对MCF-7细胞周期影响比较

表2 各组对MCF-7细胞周期影响比较(%)

2.4 各组Egr1、p21蛋白表达比较 各组干预MCF-7细胞48 h后,土贝母皂苷甲各剂量组Egr1、p21蛋白表达均升高,见图2。

2.5 各组Egr1、p21 mRNA表达比较 干预MCF-7细胞48 h后土贝母皂苷甲各剂量组Egr1、p21 mRNA表达量均高于空白组,且TBMS Ⅰ高剂量组Egr1、p21 mRNA表达量最高,差异有统计学意义(P<0.05),见表3。

表3 各组MCF-7细胞Egr1、p21 mRNA比较

3 讨 论

乳腺癌在中医典籍中称之为“乳岩”“乳疽”等,中医药在临床治疗乳腺癌已取得长足进展。土贝母皂苷甲具有广泛的生物学活性,包括抗炎、抗病毒、免疫抑制作用[11]。土贝母皂苷甲对肝癌、肺癌、结直肠癌、乳腺癌等有抗癌作用[12]。土贝母皂苷甲可通过抑制NF-κB结合活性或Wnt/β-catenin信号通路,激活MAPK-JNK通路,促进蛋白酶体VEGFR2、Tie2降解,诱导细胞凋亡,抑制细胞增殖和转移,抑制肿瘤血管生成[13-14]。

Egr1是一种由应激、损伤、丝裂原和分化诱导的即时早期反应基因,它调节多种基因表达,参与控制生长和凋亡,在各种人类癌症中发挥抑癌作用[14]。p21是位于Egr1下游的重要靶基因,是一种细胞周期蛋白依赖性激酶(Cyclin dependent kinase,CDK)抑制剂,其功能在于诱导细胞周期阻滞[15]。有研究发现,Egr1通过转录调控其下游靶基因,尤其是参与细胞周期阻滞和凋亡的p21发挥抗癌作用[16]。同时有文章表明,作为下游靶基因p21过表达,影响乳腺癌细胞周期分化,促进乳腺癌细胞凋亡[17]。

本次研究结果表明土贝母皂苷甲可以促进乳腺癌MCF-7细胞中Egr1的表达,而Egr1通过上调下游靶基因,特别是参与细胞周期停滞和细胞凋亡的p21,从而诱导凋亡。本次研究表明,土贝母皂苷甲可以抑制乳腺癌细胞MCF-7的增殖,促进Egr1的表达,进而激活其下游靶基因p21表达,引起MCF-7细胞周期G2/M阻滞,诱导乳腺癌细胞MCF-7的凋亡。因此,土贝母皂苷甲对乳腺癌的作用机制很可能是通过激活Egr1/p21信号通路,发挥抗癌作用的。

同时本次研究仅从细胞层次探讨土贝母皂苷甲可以抑制乳腺癌细胞MCF-7的增殖,分子生物学指标的改变为临床治疗提供新的理论依据,但是通过此实验的结果远远不能替代现代医学治疗乳腺癌的方案,仅对乳腺癌的治疗提供新思路,根据此前团队实验[18-20],将进一步制定体内实验方案,明确土贝母皂苷甲可以抑制乳腺癌细胞MCF-7增殖更深层次的药理学机制。