苏 越，梁琳慧*，何祥火*

1.复旦大学 生物医学研究院，上海 200032；2.复旦大学附属肿瘤医院 肿瘤研究所，上海 200032

长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是指长度200碱基对以上、不具备编码蛋白质能力的RNA。目前共有15 878个lncRNA[1]被鉴定出来。lncRNA调控许多重要的生理活动,如细胞分裂、细胞分化、细胞自噬、细胞凋亡等。大多数lncRNA分布在胞核和胞质,也有少数会分布于细胞器,如线粒体、内质网等。这些亚细胞定位的差异赋予lncRNA不同的功能。

近年来,许多新技术被用于研究lncRNA的定位。例如, 利用链霉素亲和素特异性结合开发的抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase 2,APEX2)技术[2]和免疫沉淀作用的细胞器分离技术[3]等, 这些技术使得研究lncRNA的亚细胞定位更加便捷。此外,根据lncRNA定位机制,研究人员开发了强制改变lncRNA定位的载体,比如通过两个小核仁RNA(small nucleolar RNA,snoRNA)的作用,使lncRNA留在胞核[4];通过病毒来源的出核元件[5]或来自lncRNA本身的出核响应序列[6]达到将lncRNA输出胞核的目的。

因此,通过研究lncRNA的亚细胞定位及其功能之间的联系,有助于理解lncRNA所发挥的功能及其具体分子机制,从而丰富lncRNA的基因调控网络,为lncRNA的靶向治疗提供坚实的理论基础。

1 lncRNAs亚细胞定位与其功能的关系

lncRNA是非编码RNA(non-coding RNA, ncRNA)中最普遍,功能最多样化的一个类别。有研究者将其定义为作为初级或剪接转录本发挥作用的ncRNA,它们存在于多个物种中,不过lncRNA因受到的加工不同,致使其在不同物种间的定位和功能有所差别。如FAST在人类胚胎干细胞中定位于细胞质,与E40泛素连接酶β-TrCP的WD3结构域结合,并阻断其与磷酸化β-catenin的相互作用以防止降解,导致多能性所需的WNT信号激活。而FAST在小鼠胚胎干细胞中定位于细胞核,剪接因子PPIE抑制其加工,使其不能出核,不具备促进干细胞多能性的功能[7]。

1.1 细胞核中lncRNA及其功能

通过APEX-seq技术对RNA的亚细胞定位进行分析,发现大部分lncRNA主要位于细胞核中[2],且最初的研究表明,这些核定位lncRNA为染色质调节因子,对染色体结构的维持具有重要作用。如包含端粒重复序列RNA(telomeric-repeat-containing RNA,TERRA),功能性基因间重复RNA元件(functional intergenic repeating RNA element,FIRRE)等。TERRA 是一种由亚端粒和端粒序列转录,在稳定端粒中发挥重要作用的lncRNA。TERRA通过RAD51重组酶和自身的5′-UUAGGG-3′重复序列形成R环并靶向染色体末端[8]。RAD51相关蛋白1(RAD51-associated protein 1,RAD51AP1)结合并稳定R环结构,并催化DNA链侵入端粒序列,促进端粒的选择性延伸(alternative lengthening of telomeres,ALT)相关的同源修复[9]。除了与染色质相互作用之外,细胞核中的lncRNA还能参与调控基因转录,例如巨噬细胞特异性的lncRNA MAARS通过与HuR结合,阻止HuR从细胞核转移至细胞质,调节HuR靶标如p53、p27、caspase-9和BCL2的表达,从而引起动脉粥样硬化[10];特异性生长抑制基因5(growth arrest-specific 5,GAS5)在存在丝氨酸/精氨酸剪接因子4(serine and arginine rich splicing factor 4,SRSF4)时,与糖皮质激素受体结合并抑制其与靶基因中GRE区域的结合,抑制心肌肥大的发生[11]。此外,核中的lncRNA还可以参与调控mRNA的可变剪接,例如在低氧刺激下肠癌细胞中的Lucat1可以结合多聚嘧啶区结合蛋白1(polypyrimidine tract binding protein 1,PTBP1),增强PTBP1下游转录本如CD44、CLSTN1等与PTBP1的结合,进而调节这些分子的可变剪接,促进肠癌的发生发展[12]。

1.2 细胞质中lncRNA及其功能

定位于胞质的lncRNA发挥与胞核lncRNA不同的功能。目前研究表明,它们可参与以下细胞活动:1)信号传导。如RP11-295G20.2与磷酸酶和张力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog,PTEN)的N端结合,促进p62与PTEN的相互作用。因此,PTEN易位到溶酶体中并被降解。RP11-295G20.2通过影响PTEN稳定进而调控AKT磷酸化,抑制叉头盒转录因子3a(forkhead box transcrip-tion factor 3a,FOXO3a)转运进入细胞核,抑制调节自噬相关基因的转录[13]。2)转录后调控。NORAD在食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)细胞中充当miR-224-3p的分子海绵,调节ESCC细胞中间黏蛋白(MTDH)的表达,进而促进β-连环蛋白在体外和体内的核积累,促进了ESCC细胞的顺铂抗性和进展[14]。3)翻译及翻译后修饰。Caren会阻碍组氨酸三联体核苷酸结合蛋白1(histidine triad nucleotide binding protein 1,Hint1) mRNA的翻译,进而抑制共济失调毛细血管扩张症突变-DNA损伤反应(ataxia telangiectasia mutated-DNA damage response,ATM-DDR)途径,并稳定心肌细胞中的线粒体呼吸能力,发挥心脏保护作用[15]。

有些lncRNA的核质分布在不同疾病中不同,这种定位的差异导致了同一个lncRNA在不同疾病中功能的差异。如小核仁RNA宿主基因11(small nucleolar RNA host gene 11,SNHG11)位于胞质时,通过SNHG11/miR-7-5p/磷脂酶C-β1(phospholipase C Beta 1,PLCB1)轴参与p38MAPK信号通路,抑制急性胰腺炎进展,从而为急性胰腺炎治疗提供潜在的靶点和方向[16]。位于胞核时SNHG11则与低氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor 1 subunit alpha,HIF-1α)上的pVHL识别位点结合,阻断pVHL与HIF-1α的相互作用并阻止其泛素化和降解,促进肠癌的侵袭和转移[17]。

1.3 细胞器中lncRNA及功能

少部分lncRNA会被运输至细胞器中,发挥相应的功能。在核糖体中lncRNA ZNFX1反义RNA1(ZNFX1 antisense RNA 1,ZFAS1)可以与核糖体的40s亚基结合发挥调控作用[18];利用APEX-seq检测到28条lncRNA定位在内质网。其中DNA损伤激活的非编码RNA(NORAD)、TUG1是研究较多的lncRNA,但这些lncRNA与内质网的功能有无关系尚未确定[2]。非编码RNA在线粒体的正常运转中发挥着重要作用。例如GAS5可以转位至线粒体中维持细胞能量稳态[3]。此外,一些溶酶体定位的lncRNA被筛选出来[3],但这些lncRNA的功能尚不清楚。总的来说,细胞器中包含了哪些lncRNA,这些lncRNA发挥什么样的功能还有待进一步探究。

2 lncRNA亚细胞定位的调控机制

尽管lncRNA的亚细胞定位和其功能之间存在联系,但是lncRNA是如何实现其亚细胞分布的分子机制尚不清楚,目前有少部分研究对lncRNA定位机制进行了初步探索。

2.1 核滞留机制

通常lncRNA的剪接效率低于mRNA,有些lncRNA是通过异常的RNA聚合酶Ⅱ转录产生的低聚腺苷化和不稳定的转录本,而转录和加工是高效的mRNA输出的前提,因此这种lncRNA转录和加工的改变可能会导致lncRNA的低效核输出。其次,lncRNA内部的一些顺式元件也会促进自身的核滞留,如形成R环结构、Malat1的区域E(nt:1 961～3 040)和M(nt:6 387～7 011)、SLERT含H/ACA框的snoRNA两端(SNORA5A和SNORA5C)、骨形蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP2)/OP1响应基因(BMP2/OP1-responsive gene,BORG)的五聚体序列AGCCC、Alu重复序列等都会促进lncRNA的核滞留。此外,反式因子也可以调控lncRNA促进其核滞留,如异质核糖核蛋白K(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K,hnRNPK)与Malat1中的短的分散的核元件B1相互作用以确保Malat1核斑定位[19]等等。

2.2 核输出机制

细胞内RNA的核输出机制大体分为3类,虽然对lncRNA的相关核输出机制没有特别充分的研究,但总体上和其他RNA一样:1)利用TREX-TAP途径进行核输出。TREX由保守的核心亚基如ALY、UAP56和THO亚复合物组成,TREX主要通过剪接复合物招募,以ATP依赖的方式组装,并与mRNA的5′端结合将其转运给NXF1-p15二聚体等转运因子,SRSF家族参与此过程,通过与核孔蛋白相互作用,完成出核。这个过程中NXF1优先输出具有长外显子或高A/U含量的单外显子或少数外显子转录本[20]。例如SRSF1和SRSF7识别与NF-κB作用的lncRNA(NF-κB interacting lncRNA,NKILA)的胞质积聚区域元件(cytoplasmic accumulation region in NIKLA,CARN)(251～450 nt),通过与UAP56和Aly/Ref输出因子(Aly/REF export factor,ALYREF)的相互作用促进TREX的募集,并通过TREX-TAP通路介导NKILA的输出[6]。2)通过染色体维持蛋白1(chromosome region maintenance 1,CRM1)途径输出。含有NES的适配器蛋白直接与RNA或其他RNA结合蛋白结合,招募CRM1通过核孔输出到核。lncRNA线粒体加工RNA的内切酶复合物中RNA组分(RNA component of mitochon-drial RNA processing endoribonuc-lease,RMRP)与人抗原R(HUR)相互作用,通过CRM1促进其核输出[21]。3)与核输出蛋白结合共同出核。如在葡萄糖刺激下,蛋白Pinin介导核旁斑点组装转录本1(nuclear paraspeckle assembly transcript 1,NEAT1)的核输出[22]。

2.3 亚细胞器定位机制

目前关于lncRNA亚细胞器定位的研究较少,主要聚焦于线粒体。lncRNA精确定位于线粒体的机制主要有两种:1)与定位在线粒体的蛋白形成复合物,进而共同定位线粒体。lncRNA RMRP经CRM1介导出核后,结合富集G基序结合因子1(G-rich RNA sequence binding factor 1,GRSF1),在线粒体基质中表达增加[21]。2)借由细胞通讯定位在线粒体发挥功能。Linc00473与脂滴包被蛋白(perilipin 1,PLIN1)交联实现脂滴和线粒体的共定位,激活脂解与线粒体呼吸作用[23]。

3 强制改变lncRNA定位的实验方法

在细胞受到外界刺激时,lncRNA的胞内分布发生改变。比如在糖刺激下,NEAT1和Pinin蛋白结合从胞核转移到胞质后,作为支架组装形成磷酸甘油酸激酶1(PGK1) /磷酸甘油酸突变酶1(PGAM1)/烯醇化酶1复合物(ENO1),促进糖酵解的高效发生,进而促进乳腺癌的发生发展[22]。此外,借由真核表达载体进行lncRNA的功能研究时,常受到载体本身含有的转录元件、翻译元件以及核输出元件的影响,使得外源表达的lncRNA的核质分布与期望产生差异[4]。因此研究者尝试对外源表达的lncRNA进行强制定位,以精确地揭示定位和功能之间的关系。

3.1 强制改变定位的载体

有研究者利用SLERT的核滞留机制开发了相应的Snovector,帮助lncRNA强制定位胞核[4]。而lncRNA的出核可以通过增加一段病毒出核序列元件比如胞质积聚元件(cytoplasmic accumulation element,CAE)、持续性输出元件(constitutive transport element,CTE)、胞质积聚区域元件(cytoplasmic accumulation region element,CARE)以及NKILA的出核序列CARN实现强制出核。目前本实验室正在寻找其他的胞质定位序列,并尝试将已发现的胞质定位元件与不同亚细胞定位的lncRNA进行组合,寻找核输出组合的最佳方式。

3.2 研究lncRNA亚细胞定位的新技术

为了研究细胞内各结构中是否存在及存在哪些lncRNA,研究者开发应用了一些新技术。1)APEX-seq: APEX2是大豆抗坏血酸过氧化物酶的进化突变体,苯酚是一种膜透性小分子,APEX2可催化生物素-苯酚的单电子氧化,产生半衰期<1ms 生物素-苯酚自由基,共价偶联到蛋白质侧链上,使得以该蛋白为中心,周围几纳米范围内的物质都被生物素标记,通过链霉亲和素-生物素结合富集生物素标记的RNA进行测序[2]。2)通过细胞器标志蛋白免疫共沉淀,得到特异的细胞器组分从而测序。譬如通过线粒体、溶酶体、内质网的代表蛋白Tom20、 LAMP2、 Calnexin筛选出线粒体定位的GAS5并研究其在能量代谢中作用[3]。

4 问题与展望

lncRNA是目前的研究热点之一,越来越多有功能的lncRNA被发现,但也存在许多尚未解决的问题,尤其是其定位与功能的关系,亟需更多研究来探索。lncRNA在不同癌种之间的亚细胞定位是否固定?同一种细胞中,lncRNA是否出现不同的定位?这些不同的定位是否有功能差异?什么分子机制造成了这样的定位分布?定位在线粒体的GAS5是如何准确定位到线粒体?这些问题正逐渐成为下一阶段lncRNA研究的热点。鉴于lncRNA在细胞中发挥着重要作用,通过靶向lncRNA来治疗疾病被认为是一种非常有前景的方法。有研究发现针对NATs的反义寡核苷酸(anti-sense oligonucleotide,ASOs)在中枢神经系统的基因再活化方面显示出了非常有希望的临床前结果[24]。