顾文珍 刘昱慧 谭诗文 王蓉 张姝 倪红霞

宁波市疾病预防控制中心病毒研究所，宁波 315010

HIV 可分为HIV-1 和HIV-2 两型，HIV-1 型是艾滋病的主要流行型，呈全球性流行趋势。HIV-2 型主要在非洲少数国家呈局限性流行，根据ENV 基因核酸序列差异，HIV-1 型可以分为M、N 和O 3 个组， A、B、C、D、E、F、G、H、I、J 和K 11 个亚型。 2015年全国第4 次HIV 分子流行病学调查显示， 我国HIV 流行株基因亚型呈现更加复杂和多样化特征，同时出现了多种流行重组型(circulating recombinant form, CRF)和独特重组型(unique recombinant form,URF)[1], 主要流行亚型为CRF07_BC、CRF01_AE、CRF08_BC 和B 亚型。

HAART 能够有效地控制HIV 感染率， 降低患者病死率， 于此同时HAART 加速耐药株的产生与传播，耐药毒株能降低抗病毒药物的有效性，进而导致治疗失败，发病率和死亡率增加[2]。 宁波市自1990 年首次在劳务输出渔民中发现HIV 感染者以来，报告病例数量不断增加，年龄分布跨度大。 本研究通过分析宁波市2022 新报告年HIV-1 感染者的人口学特征， 病毒基因亚型分布和原发性耐药情况，为宁波市HIV-1 疾病预防和检测治疗提供科学依据。

对象与方法

一、研究对象

收集2022 年1—12 月宁波市新报告HIV-1 感染者，获知情同意书并采集全血样本。 流行病学信息来源于国家疫情网络直报系统。 该研究通过宁波市疾病预防控制中心医学研究伦理审查（审查号为202304）。

二、核酸提取及PCR 扩增

2022 年新报告感染者初次随访检测时抽取4～8 mL 乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA) 抗凝全血， 全血样本离心收集血浆分装后于-80 ℃冻存备用。 采用DNA/RNA 提取试剂盒从200 μL 血浆样本中提取RNA。 逆转录后巢式PCR扩增HIV-1 的pol基因蛋白酶(全长)和逆转录酶区(前300 个氨基酸位点)， 扩增产物大小为1 316 bp。扩增体系和扩增条件参照文献［3］，PCR 扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳，DNA Marker 比对确认是否含目的片段，目标产物送至杭州擎科生物技术有限公司进行纯化和测序。

三、基因亚型及耐药性分析

使用Sequencher 5.0 软件对测序返回的序列进行拼接和编辑， 使用BioEdit 7.2.0 软件将样本序列和国际参考株序列(来自美国Los Alamos 国家实验室的HIV 序列数据库) 进行比对和校正， 用Mega 6.0 软件构建系统进化树(邻接法)， 选择Kimura 2-parameter 模型(Bootstrap=1 000)， 系统进化树确定HIV 毒株亚型。 将整理好的序列提交美国斯坦福大学HIV 耐药数据库(https://hivdb.stanford.edu/) 在线进行HIV 耐药相关突变分析。

四、序列重组和传播簇分析

根据系统进化树分析， 未能与已知的亚型和CRFs 聚类的序列考虑为URF，采用美国Los Alamos国家实验室HIV 序列数据库RIP 重组分析工具和jpHMM-HIV 分析重组类型， 并使用SimPlot3.5.1 软件进一步复核。 传播簇定义：系统进化树中分簇的Bootstrp≥90%， 簇内样本数≥2， 簇内平均基因距离≤0.015。

结果

一、基本情况

2022 年宁波市新报告HIV-1 感染者628 例，收集抗凝血样本560 份， 成功获得核酸序列478 例，有完整流行病学资料426 例。 男性占82.2%（350/426）； 汉族占95.3%（406/426）； 年龄≥40 岁占52.6%（224/426）；文化程度初中占32.9%（140/426），大专及以上占25.4%（108/426）； 已婚有配偶占43.0%（183/426），未婚占36.2%（154/426），离异或丧偶占18.5%（79/426）；异性传播占56.3%（240/426），同性传播占43.4%（185/426），母婴传播1 例；职业中农民/工人占比最高为36.0%（153/426），其次为家政/家务及待业占27.5%（117/426）。

二、序列亚型分析

426 例HIV-1 感染者的核酸序列包括15 个基因亚型，优势基因型为CRF07_BC（42.0%，179/426）和CRF01_AE （30.5%，130/426)， 其次依次为URF(01_AE/07_BC) (7.0%，30/426)、CRF 08_BC（6.6%，28/426)、CRF 55_01B （4.9% ，21/426)、CRF85_BC（2.3%，10/426）、B (2.1%，9/426)、C （1.9%，8/426)、URF(B/C) (0.7%，3/426)、URF (01_AE/C)（0.5%，2/426）、URF (01_AE/B) （0.5% ，2/426）、CRF59_01B（0.2%，1/426）、CRF64_BC （0.2%，1/426）、CRF67_B（0.2%，1/426）和A1（0.2%，1/426）。 详见图1。

三、序列重组分析

使用在线工具jpHMM 及RIP 对37 例URF 进行重组分析：URF(01_AE/07_BC) 30 例、URF (B/C) 3例、URF (01_AE/C)和URF (01_AE/B) 各2 例。 流行病学资料显示：37 例病例中34 例为男性，22 例有非婚异性接触史，16 例为男男同性传播， 部分病例同性性行为人数较多， 最多高达10 人。 其中22NB243 和22NB429 为男男性伴侣，22NB243 是传染源， 22NB530 和22NB717 为男男性伴侣。

四、传播簇分析

本次研究共发现40 个传播簇， 成簇样本数占样本数比最高的3 个基因型为： CRF08_BC 占50.0%（14/28），CRF07_BC 占36.9%（66/179），URF(01_AE/07_BC) 占30.0%(9/30)。 CRF08_BC 有4 个传播簇， 共14 个病例， 最大传播簇有7 个病例；CRF07_BC 有20 个传播簇，共66 个病例，最大传播簇有12 个病例；URF (01_AE/07_BC) 有2 个传播簇， 共9 个病例， 最大传播簇有7 个病例。 URF(01_AE/07_BC)传播簇分析，该传播簇有7 例病例，5例为宁波市北仑区MSM 人群。

五、耐药传播分析

将pol区序列提交至美国斯坦福大学HIV 耐药数据库中进行比对，426 例样本中27 例存在耐药突变，治疗前总体耐药率为6.3% (27/426)。 对非核苷类逆转录酶抑制剂(NNRTIs)、核苷类逆转录酶抑制剂(NRTIs) 和蛋白酶抑制剂(PIs) 的耐药率分别为3.8%(16/426)、1.9%(8/426)和0.9% (4/426)。含有高度耐药相关的突变有21 例， 总体高度耐药比例达到4.9%（21/426），均为针对逆转录酶抑制剂相关耐药。与NNRTIs 相关耐药位点中， 占比较高的有K103N（0.9%，4/426）、G190S（0.9%，4/426）和K101E（0.7%，3/426）； 与NRTIs 相关耐药位点中， 占比较高的有M184V（0.9%，4/426）。1 例对NRTIs 和NNRTIs 都存在耐药位点，包括184V、T215I 和Y181C 突变；1 例对NNRTIS 存在K103S 和G109A 两个位点突变。具体耐药位点和药物见表1。

表1 宁波市2022 新报告HIV 感染者抗病毒治疗前耐药率和耐药位点（n=426）

讨论

pol基因编码聚合酶前体蛋白，经切割形成蛋白酶、整合酶、逆转录酶、核糖核酸酶H 等，由于逆转录酶缺乏3'→5'外切酶活性, 使得HIV 在复制的过程中不能校正错误掺入的单核苷酸, 从而表现出易错倾向,使得HIV 产生高度变异，有非常复杂的基因型和重组基因型。 目前全球流行的HIV 有11 种基因亚型和130 多种CRF 以及几十种URF，HIV 的进化和传播已经导致全球HIV-1 亚型、CRF 及URF出现地域化分布特征[4-6]。

一、宁波市HIV 呈多种基因亚型并存且新的亚型不断出现

宁波市HIV 流行形势不断变化，新的亚型从不同国家和地区传入，宁波市流行的基因型也呈现多样化和复杂化特点。2010 年宁波市仅监测到5 种基因亚型， 未检测到URF， 具体包括CRF01_AE（44.4%)、CRF07_BC（25.0%）、CRF 08_BC（11.1%）、C(11.1%）和B(8.4%)，而2012 年中国URF 的占比仅为4.4%[7]。 2022 年宁波市监测到15 种基因亚型，URF 占比高达8.7%， 以CRF01_AE 为重组结构模式的URF 为主占7.0%， 基因分型较其他省市更多样化和复杂化，与曹栋卿等[8]对2018—2019 年浙江省绍兴市研究结论相似。 杨介者等[9]报道2015 年浙江省HIV 流行基因以CRF07_BC 和CRF01_AE 为主，CRF07_BC 超过CRF01_AE 成占比最高的基因型，以及以CRF01_AE 为重组模式结构的URF 呈上升趋势。袁子焰等[10]分析了1990—2020 年间亚洲地区HIV-1 基因型的流行特征， 发现B 亚型和CRF01_AE 亚型已经是东亚地区的主要流行类型。可见随着HIV-1 流行时间的推移和传播途径的多样化，宁波市HIV-1 呈现多种基因亚型并存且新的重组亚型不断出现特点，给艾滋病防控工作带来极大挑战。

CRF07_BC 是宁波市最高比例的基因型，有20个传播簇，涉及宁波市每个区县。 建议对新报告病例及时进行分型及分子网络分析，与基因库中传播簇比较，及时发现和快速应对新近出现或扩大的传播簇， 对高危行为人群及接触者干预和溯源调查，从源头上控制传染病发生发展。 CRF 55_01B 起源于广东省MSM 人群， 然后迅速在全国各地流行，2018 年全国31 个省份均监测到CRF 55_01B[11]，浙江省首例CRF 55_01B 毒株是2011 年在MSM 人群中发现的， 传播方式也由MSM 人群同性传播扩散到异性传播， 双性恋男性在CRF 55_01B 传播和扩散中起了重要作用[12]。 宁波市2022 年共监测到21例CRF 55_01B 病例，20 例男性病例，10 例为男男同性性传播。 1 株CRF59_01 亚型毒株与深圳市发现的CRF59_01 亚型毒株序列高度相似，为96.5%；1 株CRF64_BC 亚型毒株与北京地区发现的CRF64_BC 亚型毒株相似度为 97% 、1 株CRF67_01B 亚型毒株与深圳地区发现的CRF67_01B 相似度为97.86%；1 株A1 亚型毒株与北京发现的A1 亚型毒株相似度为95.38%，对于新发现基因型需要连续关注，防止继续渗透传播。

二、 宁波市2022 年新报告病例URF 基因型与国内一些地区的序列相似度高

宁波市2022 年有4 个URF， 主要为URF(01_AE/07_BC)， 即CRF01_AE 与07_BC 发生二代重组，国内多个城市均有URF(01_AE/07_BC)病例报道，且已经在人群中广泛流行[6,13-16]，由于宁波地区主要流行基因型为CRF01_AE 与07_BC，同时存在多种亚型共流行及复杂的传播网络，容易造成亚型混合感染， 继而导致基因重组并产生新的URF，再传播给其他个体。 URF(01_AE/07_BC)有2 个传播簇，其中1 个传播簇中的22NB717 毒株与深圳发现的URF(01_AE/07_BC)亚型毒株有97%相似度；另1个传播簇的22NB243 毒株与深圳发现的URF(01_AE/07_BC) 亚型毒株有95.94%同源性；URF(01_AE/C) 亚型毒株2022 NB227 与石家庄发现的URF (01_AE/C) 亚型毒株相似度为96%。 URF(01_AE /B)22NB408 亚型毒株与深圳发现的URF(01_AE /B) 亚型毒株相似度为97%；URF (B/C)NB462 与云南发现URF (B/C) 亚型毒株相似度为96%。宁波市发现的URF 主要与深圳等发达地区及昆明HIV 高发地区序列相似度较高。

三、 宁波市2022 年新报告病例治疗前处于中度耐药

HIV 是一种RNA 逆转录病毒， 其RNA 逆转录酶具有复制能力却没有校正功能。 在药物的选择压力下，HIV 更易出现变异，产生耐药突变，这是导致HIV 耐药的根本因素[17]。本文耐药检测结果显示，宁波市2022 年报告HIV 感染者治疗前耐药率为6.3%(27/426) ，处于中度耐药，低于重庆市2014—2017 新确诊HIV 感染者耐药率[18]。出现频率较高的耐药突变位点是M184V、K103N、G190S、K101E 和V106M，与台州市2016—2018 年研究相似[19]。 这些位点均可引起对NRTIs 类药物的高水平耐药，NRTIs 类药物是 《中国艾滋病诊疗指南(2021 版)》[1]一线推荐用药, 广泛使用增加了耐药毒株产生的风险。 2021 年WHO HIV 耐药监测指南建议每3 年进行一次全国性治疗前耐药调查， 以便实时掌握HIV的耐药情况并指导治疗。

综上所述， 宁波市2022 年新报告HIV 感染者毒株呈现复杂化和多样化特点，治疗前耐药处于中度水平。 建议加强加大及时对新报告病例分子分型，强化流行病学及社会网络的调查和干预，并进一步加强对新报告病例治疗前耐药检测和优选敏感治疗方案。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献声明顾文珍：实验设计和操作、数据采集、分析和撰写论文； 刘昱慧：实验设计和操作，数据分析；谭诗文：数据采集和分析；王蓉：实验操作和序列分析； 张姝、倪红霞：行政支持、研究指导、工作支持