陈丽萍，廉晓丽，蔡子涵，李 倩，欧阳天昭，杨毅梅

（1.大理大学基础医学院，云南大理 671000；2.山西医科大学晋祠学院，太原 030000；3.大理大学临床医学院，云南大理 671000；4.大理大学第一附属医院，云南大理 671000）

肝吸虫Clonorchis sinensis是一种食源性人畜共患寄生虫，人或猫、狗等食入含有活囊蚴的淡水鱼、虾后，在消化液作用下，幼虫循胆汁逆行至肝胆管发育为成虫。以寄生部位上皮增生、结构紊乱及扩张为主要病理变化的肝吸虫病，如没有正确诊断并及时治疗，可发展为肝胆慢性炎症、胆汁性肝硬化甚至肝胆管恶性肿瘤〔1〕。持续炎症、肝吸虫感染等是引起胆管癌的主要诱因，肝胆管恶性肿瘤的预后差、生存率低〔2〕。由于肝吸虫早期及低度感染时无明显临床症状，易导致治疗延误，对宿主造成不良后果。因此，只有早发现并及时治疗才能减少其对宿主的实质性损害。

目前，肝吸虫病的诊断方法主要是粪便或胆汁查虫卵及血清抗体检测。病原检测发现肝吸虫虫卵是确诊的依据，但肝吸虫虫卵不明显，易被污染物覆盖而漏检〔3〕。肝吸虫在宿主体内发育和寄生的过程中主要产生特异性IgG 抗体〔4〕。血清IgG 抗体检测是诊断肝吸虫感染的有效方法，但IgG 抗体通常在感染一段时间后才开始产生，无法早期诊断及分辨感染的时期，且经治疗痊愈后抗体水平变化不明显，无法用于肝吸虫病的疗效考核，而检测循环抗原可弥补上述不足〔5-6〕。肝吸虫循环抗原是虫体在发育过程中产生的虫卵抗原及虫体分泌物等，在肝吸虫感染早期、急性期或活动期的血液中存在，是肝吸虫现症或急性感染的证据，可作为活虫感染的标志并用于疗效考核〔7-8〕。由于血清中肝吸虫循环抗原成分较难获取，研究〔9〕证明循环抗原的主要成分是排泄分泌抗原，但其在血清中的含量较低，目前使用常规免疫学方法检测的研究甚少，研发高灵敏的检测方法是当下早期诊断肝吸虫病所面临的新课题。

纳米金是指在三维结构中至少有一维小于100 nm 的金粒子，其合成简单、体积小、表面易于修饰、生物相容性好，单位面积可结合多个生物分子从而起到信号放大的作用，且结合后生物分子的活性几乎不会发生改变〔10-11〕。纳米金棒是一种棒状纳米金，通过紫外分光光度计扫描可见横向和纵向2个吸收带，其中纵向吸收带的位置随着其纵横比的增加而产生位移，能实时反映抗原-抗体的相互作用〔12〕。因此，本研究在李家萌〔13〕对纳米金棒的最佳聚合条件研究基础上，将纳米金棒与巯基化的特异性抗体结合，利用其纵向吸收带的特性，对肝吸虫感染的大鼠血清循环抗原进行检测。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 HAuCl4（上海杰泰生物技术公司，批号：A601926）；十六烷基三甲基溴化铵（CTAB，华美生物工程公司，批号：112-020-74）；NaBH4（成都华夏化学试剂有限公司，批号：MFCD0035）；乙二胺四乙酸（EDTA，碧云天生物技术有限公司，批号：C0503）；AgNO3（华夏试剂公司，批号：20563439）；抗坏血酸（晶美生物工程有限公司，批号：20006621）；特劳特试剂（上海生工公司，批号：TR4720853）；PEG-6000（北京索莱宝生物科技有限公司，批号：473-3CWRD）；PAGE 蛋白回收试剂盒（上海雅酶生物科技有限公司，批号：PG114）；BCA 蛋白定量试剂盒（Signalway Antibody 公司，批号：3415）；大鼠血清抗体酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒（昆明娇曼生物有限公司，批号：D2020495）。

1.2 实验动物 含有活囊蚴的麦穗鱼由广西医科大学提供；健康雄性SD 大鼠（150～200 g），购自大理大学动物实验中心，动物生产许可证号：SCXK（云）2021-0015。

1.3 制备肝吸虫特异性IgG 抗体

1.3.1 建立大鼠肝吸虫病模型 将含有活囊蚴的麦穗鱼用清水冲洗数遍，剪刀剪去鱼的鱼鳍、鱼尾、鱼骨等，剩下的鱼肉剪碎放入绞肉机绞成肉泥，将鱼肉和消化液以1∶10 的比例混合，置于恒温摇床中消化过夜约10 h。将消化后的鱼肉过滤到量杯中，倒出上清液留沉淀，重复4～5 次，直到分离出沉渣中的囊蚴，以备灌胃。将待感染的SD 大鼠分为3组，每组20 只，按囊蚴感染量50、100、200 条，分别对大鼠进行灌胃，即获得大鼠肝吸虫病轻度、中度、重度感染模型。

1.3.2 收集不同感染度、不同感染时间大鼠血清样品 收集轻度、中度、重度感染后3、10、17、31 d 的大鼠眼内眦静脉血样，4 ℃放置数小时，4 000 r/min离心30 min，-80 ℃储存备用。

1.3.3 纯化并鉴定肝吸虫特异性IgG 抗体 利用亲和层析法纯化收集的血清，鉴定纯化后的肝吸虫特异性IgG 抗体纯度。

1.4 纳米金棒标记肝吸虫特异性IgG 抗体及抗体筛选

1.4.1 制备金晶种子液 混合0.2 mmol/L CTAB 1.88 mL、2 mmol/L HAuCl4625 μL、纯水1.37 mL，将4 ℃冰箱中现配的0.01 mmol/L NaBH4450 μL 加入上述混合液中，快速震荡2 min，27 ℃放置120 min。1.4.2 制备生长媒介及聚合纳米金棒 向50 mL离心管中加入0.2 mmol/L CTAB 11.88 mL、纯水7.71 mL、2 mmol/L HAuCl45.00 mL、10 mmol/L AgNO3150 μL、100 mmol/L 抗坏血酸160 μL 混匀制备成生长媒介。取108 μL 金晶种子液，加入25 mL 生长媒介中，27 ℃孵育12 h 后用紫外分光光度计扫描纳米金棒，对其吸收峰进行分析。

1.4.3 纯化纳米金棒 参照文献〔14〕的方法并稍加改进，将纳米金棒悬浮液8 500 r/min 离心20～40 min，留沉淀，加入纯水，13 000 r/min 再次离心10 min，弃上清液，加入新配制的0.5 mmol/L CTAB 1.5 mL，获得高纯度的纳米金棒。

1.4.4 制备肝吸虫特异性IgG 抗体纳米金棒及抗体筛选 将BCA 蛋白定量试剂盒测定的特异性IgG 抗体稀释至10、20、30、40 μg/mL，各取200 μL分别加到800 μL 含EDTA 的PBS 缓冲液灭菌管中，再加入5 mg/mL 特劳特试剂5 μL 混合，27 ℃放置60 min。将处理后的特异性抗体混合液进行脱盐，除去杂抗体，收集所需的特异性抗体。将处理后的抗体100 μL 加至2 mL 分装的纳米金棒溶液中，静置数分钟后加入1 mL PEG-6000 溶液，28 ℃放置120 min，用紫外分光光度计扫描标记不同浓度特异性IgG 抗体纳米金棒，根据吸收峰位移变化确定特异性IgG 抗体的最佳标记浓度。

1.5 筛选并鉴定循环抗原组分

1.5.1 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析循环抗原 SDS-PAGE 法纯化获得不同感染时间血清样品中分子量为26、28 kDa的血清排泄分泌纯化抗原条带，用PAGE 蛋白回收试剂盒收集凝胶中的蛋白质。

1.5.2 肝吸虫血清循环抗原的抗原性鉴定 采用BCA 蛋白定量试剂盒测定血清循环抗原浓度，分别向400 μL 含EDTA 的PBS 缓冲液中加入上述不同感染时间的循环抗原100 μL，再取5 mg/mL 特劳特试剂5 μL，加入上述混合液中，27 ℃放置60 min。将处理后的循环抗原混合液进行脱盐，直至收集到所需抗原。取上述循环抗原200 μL 与4 mL 纳米金棒溶液混匀5 min，加入2 mL PEG-6000，28 ℃放置120 min。紫外分光光度计测定纳米金棒的吸收峰，判断是否标记成功。向2 mL 纳米金棒标记的不同时间肝吸虫循环抗原内各加入40 μL 大鼠阳性血清抗体，28 ℃反应10 min。

1.6 肝吸虫特异性IgG 抗体纳米金棒检测血清循环抗原 用肝吸虫特异性IgG 抗体纳米金棒分别检测不同感染度、不同感染时间、不同稀释度的血清循环抗原，检测结果与阴性对照进行对比。

1.7 ELISA 检测肝吸虫血清特异性抗体 用ELISA 试剂盒检测肝吸虫不同感染度、不同感染时间、不同稀释度的血清特异性抗体，检测结果与临界值进行对比。本研究的临界值为0.211 5。

2 结果

2.1 肝吸虫特异性IgG 抗体纯化结果 肝吸虫特异性IgG 抗体纯化后显示2 个条带。见图1。

图1 原始样品及抗体纯化后流出各部分电泳图

2.2 肝吸虫特异性IgG 抗体最佳标记浓度 纳米金棒分别标记浓度为10、20、30、40 μg/mL 的特异性IgG 纯化抗体，结果显示标记前后纳米金棒吸收峰均发生不同程度的位移，位移分别为10.0、20.0、15.0、4.0 nm。抗体标记浓度为20 μg/mL 时，吸收峰位移最大为20.0 nm，表明肝吸虫特异性IgG 纯化抗体最佳标记浓度为20 μg/mL。

2.3 循环抗原各组分电泳结果 SDS-PAGE 法纯化获得不同感染时间大鼠血清样品的电泳条带，结果显示各时间点的血清样品中均有分子量为26、28 kDa 的排泄分泌纯化抗原条带。见图2。

图2 不同感染时间大鼠血清SDS-PAGE 电泳图

2.4 肝吸虫血清循环抗原的抗原性鉴定结果 纳米金棒分别标记感染后3、10、17、31 d 的肝吸虫排泄分泌纯化抗原，检测肝吸虫阳性血清抗体。结果表明，检测前后纳米金棒吸收峰均不同程度地发生位移，位移分别为13.0、15.5、16.5、15.5 nm，检测结果均为阳性，即不同感染时间的肝吸虫排泄分泌纯化抗原均能识别阳性血清抗体。因此，不同感染时间的肝吸虫排泄分泌纯化抗原均具有较强的抗原性。

2.5 肝吸虫特异性IgG 抗体纳米金棒血清循环抗原检测结果

2.5.1 不同程度感染后3 d 大鼠血清循环抗原光谱扫描结果 阴性对照血清的吸收峰最大位移为2.0 nm，用肝吸虫特异性IgG 抗体纳米金棒检测轻度、中度、重度肝吸虫囊蚴感染后3 d 大鼠血清循环抗原的吸收峰最大位移分别为3.0、11.0、13.0 nm。见图3 A～C，检测结果为阳性。

图3 肝吸虫特异性IgG 抗体纳米金棒检测不同程度感染后3 d 大鼠血清循环抗原光谱扫描曲线

2.5.2 肝吸虫特异性IgG 抗体纳米金棒检测相同感染度、不同感染时间血清循环抗原结果 用肝吸虫特异性IgG 抗体纳米金棒对感染度相同、感染时间分别为3、10、17、31 d 的血清循环抗原进行检测，结果均为阳性。肝吸虫特异性IgG 抗体纳米金棒与轻度感染后的血清循环抗原反应，吸收峰分别移动了3.0、17.5、10.5、12.0 nm；与中度感染后的血清循环抗原反应，吸收峰分别移动了11.0、20.0、14.0、32.5 nm；与重度感染后的血清循环抗原反应，吸收峰分别移动了13.0、25.0、16.0、34.5 nm。见图4。表明肝吸虫特异性IgG 抗体纳米金棒可检出50、100、200 条囊蚴感染后3、10、17、31 d 的血清循环抗原。

图4 肝吸虫特异性IgG 抗体纳米金棒检测相同感染度、不同感染时间血清循环抗原吸收峰位移结果

2.5.3 不同稀释度的大鼠血清循环抗原光谱扫描结果 肝吸虫特异性IgG 抗体纳米金棒检测稀释度为1∶100、1∶200、1∶400、1∶600 的大鼠血清循环抗原，吸收峰位移分别为9.0、7.0、4.5、1.0 nm。见图5 A～D。其中稀释度为1∶600 的检测结果为阴性，其他检测结果均为阳性。

图5 肝吸虫特异性IgG 抗体纳米金棒检测不同稀释度血清循环抗原光谱扫描曲线

2.6 ELISA 检测肝吸虫血清抗体结果 ELISA 检测结果显示，轻度感染后第17 天、中度和重度感染后第10 天、第17 天出现阳性结果。见表1。稀释度为1∶100 的血清抗体结果为阳性。见表2。

表1 ELISA 检测肝吸虫不同感染度感染大鼠后不同时间的血清抗体结果

表2 ELISA 检测不同稀释度的肝吸虫感染大鼠后血清抗体结果

3 讨论

本研究采用优化的金晶种子生长法成功聚合出纵横比稳定的纳米金棒，利用Au-S 共价键结合的方式将巯基化的肝吸虫特异性IgG 抗体包被在纳米金棒表面〔15〕，通过紫外分光光度计测定纳米金棒的吸收峰位移，优选出高敏感性的肝吸虫特异性IgG 抗体纳米金棒，并检测不同感染度及不同感染时间血清循环抗原。当血清循环抗原与纳米金棒上的肝吸虫特异性IgG 抗体反应后，再次增大纳米金棒的纵横比，使得纳米金棒固有频率发生改变，从而引起纳米金棒纵向吸收峰再次产生位移，实现了对肝吸虫感染的微量血清循环抗原的检测，建立了早期肝吸虫病的临床诊断实验基础。

由于肝吸虫血清排泄分泌抗原具有高活性成分，因此可用于诊断肝吸虫病〔16〕。Li 等〔17〕证实肝吸虫血清排泄分泌抗原中存在多种蛋白条带，其中分子量为26、28 kDa 是特异性较强的蛋白条带，与其他寄生虫无交叉反应。为鉴定其抗原性，构建了不同时间的肝吸虫血清排泄分泌纯化抗原纳米金棒检测大鼠血清抗体，通过吸收峰的位移判断不同感染时间排泄分泌纯化抗原的抗原性。结果显示，不同感染时间的排泄分泌纯化抗原纳米金棒均可检测出大鼠血清抗体，抗原性强，可作为肝吸虫病的诊断抗原。

分析肝吸虫特异性IgG 抗体纳米金棒检测不同感染度、不同感染时间的大鼠血清结果，能间接发现宿主体内循环抗原的动态变化。肝吸虫特异性IgG 抗体纳米金棒与轻度感染后3、10、17、31 d 的血清循环抗原反应，吸收峰分别移动了3.0、17.5、10.5、12.0 nm，说明感染后3 d 就可检测出最低感染量为50 条囊蚴的血清循环抗原，且感染后10 d 吸收峰的位移较感染后17 d 的大，推测是早期感染后产生的循环抗原还没有被宿主免疫系统清除，而与纳米金棒上的特异性IgG 抗体结合，使得吸收峰位移较大。研究〔18〕发现IgG 抗体于感染后14 d 开始上升，宿主体内的循环抗原被逐渐清除，使得循环抗原逐渐减少，因此感染后17 d 吸收峰的位移减小。而感染后31 d 吸收峰位移增大，分析原因应该是宿主体内的虫体发育成熟，循环抗原的量增多。ELISA 结果也证实，轻度感染后17 d、中度和重度感染后10、17 d 的大鼠血清特异性抗体为阳性反应，判断是因为感染度与血清抗体含量成正比。宿主体内抗体滴度的动态变化与相同感染度、不同感染时间吸收峰位移先增大、后减小、再增大的规律相符。相同时间内，轻度、中度、重度感染的吸收峰位移逐渐增加，说明随着感染量的增加，循环抗原的量越多，与纳米金棒上的特异性IgG 抗体结合得越多，吸收峰位移越大，即宿主体内的循环抗原的含量与虫体数量呈正相关。经临床有效治疗后虫体数量逐渐减少，血清中循环抗原的量逐渐减少，位移减小。因此，肝吸虫血清循环抗原的检测不仅可作为肝吸虫感染早期及低虫荷的诊断依据，也是判断临床治疗效果的评估依据。

本研究进一步检测了稀释度为1∶100、1∶200、1∶400、1∶600 的血清循环抗原，结果显示吸收峰分别位移了9.0、7.0、4.5、1.0 nm。由此可见随着稀释度的增加，抗原抗体反应的比例降低，使得吸收峰位移逐渐减小。稀释度为1∶600 时，吸收峰位移仅为1.0 nm，推测是由于误差造成。ELISA 仅能检测到稀释度为1∶100 的血清抗体，实验结果证明纳米金棒具有更高的灵敏度。

本研究结果证实了肝吸虫特异性IgG 抗体纳米金棒可用于检测血清循环抗原，且具有检测时间早和灵敏度高的优势。针对肝吸虫感染者可在早期感染、低度感染时提供诊断依据，在肝吸虫患者治疗过程中循环抗原的检测可为临床医生提供治疗效果的评估，更好把握疗程，提高疗效。纳米金生物技术更大的拓展空间源于纳米金棒合成简单、检测快速且稳定性强、结果观察不需要特殊的仪器等特点，其优势完全满足了即时检验的要求，为实现在患者床旁进行疾病的快速诊断和监测奠定了良好的基础，国外已有研究〔19〕表明，纳米金诊断技术与即时检验的结合已经成为个人医疗领域全集成即时检验系统发展的最新趋势，应用前景可观。