王廷敏,谢安国,2,付淑亚,刘云宏*

1(河南科技大学 食品与生物工程学院,河南 洛阳,471023) 2(南阳理工学院 张仲景国医国药学院,河南 南阳,473004)

牛肉作为一种具有较高营养价值的保健型肉类食品,在我国的消费量仅次于猪肉和禽肉[1]。牛肉中蛋白质含量达到了20%左右,并含有人体所需的所有必需氨基酸[2]。牛肉经过热加工处理后,其所含的蛋白质会发生变性、降解,脂肪也会因为氧化反应产生相应变化,水分含量和分布情况也会发生较大改变,进而影响牛肉的品质[3]。肉制品生产加工中,按灭菌温度的高低可分为高温肉制品和低温肉制品。高温肉制品是指加热杀菌时食品中心温度大于115 ℃并持续一段时间,灭菌彻底,因而商品货架期长。低温肉制品是采用较低的杀菌温度进行巴氏杀菌的肉制品,肉制品中心温度达到68～72 ℃时可保温30 min左右,能够较好地保留原有的风味物质和营养成分。因此不同加热温度在肉品工业中都有合适的应用场景。

水分的组成和分布是牛肉肌肉的一个重要质量指标,对牛肉的质构、色泽和商业价值有显著的影响。低场核磁共振技术(low-field nuclear magnetic resonance,LF-NMR)可以用来研究牛肉的水分迁移情况,它作为一种快速发展的新兴技术,在肉及肉类产品的检测中已经得到广泛的应用[4]。通常认为肉品弛豫特征峰能够反映肉中不同水分状态的分布情况,赵家艺等[5]研究发现酱卤牛肉的质构特性及水分变化与二次加热温度呈规律性变化。马纪兵等[6]研究牦牛肉在风干过程中水分迁移规律,探讨了核磁参数与组织结构和质构之间的相关性,结果发现随着风干时间的延长,肌原纤维横截面积、肌纤维直径以及肌间距离显著降低,牦牛肉的硬度、内聚性、胶着性、咀嚼性则显著增大。

光谱分析检测技术具有较高的灵敏度、其选择性很强,能够实现无损、快速地检测样品,通常作为一种快速评估肉类化学成分的技术。如今,近红外(near-infrared,NIR)光谱已成功应用于牛肉行业化学成分的测量例如,它被用来测定牛肉成分和质量特性[7]。此外,光谱分析技术还被用于牛肉和猪肉的挥发性盐基氮的含量测定[8];结合化学计量学方法定量鉴定牛肉肉糜掺假情况[9-10]。然而,近红外光谱数据庞大,光谱信息复杂,不同结构信息的图谱重叠严重,限制了光谱进一步分析。二维相关分析可将传统的一维光谱扩展到二维,能提高光谱的分辨率和重叠峰的分离度[11-12]。而移动窗口技术[13-14]可以观察出官能团随外界干扰发生变化的时间段,能够将物质的静态检测转变为动态分析,明显的对比出不同温度对肉品的影响。核磁共振反映的是氢质子的运动状态,而近红外光谱反映了含H键官能团的分子振动状态。2种独立的技术从不同维度上反映了水分子的结构与状态,起到了相互补充,相互印证的作用。将核磁、近红外与移动窗口二维光谱技术相结合,在解决不同官能团重叠、准确识别光谱信号变化的同时,还能确定官能团发生变化的时序以及官能团与不同分子水的相似来源。

近年来,利用低场核磁或近红外研究牛肉加工方面已有文献报道,但未见将核磁、近红外与移动窗口二维相关光谱技术相结合应用于食品领域的相关研究。本研究从分子层面出发,利用现代光谱技术依次从红外谱、二维相关谱、近红外-核磁异质谱图逐级对牛肉熟化过程进行动态跟踪。通过分析谱图特征峰变化趋势和规律,探讨不同加热温度对牛肉水分状态的影响,揭示牛肉熟化过程中的结构变化机理,确定各种官能团的变化时序,为牛肉熟化机制研究提供一种新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

试验样品:牛肉里脊(河南,洛阳,优品生鲜超市)。

1.2 仪器与设备

JA5003B型电子分析天平,上海精科仪器有限公司;DHG9425A型鼓风干燥箱,上海恒科学仪器公司DF-101S型集热式恒温加热磁力搅拌器,河南省予华仪器有限公司;MINI20-015V-I型低场核磁共振成像分析仪,上海纽迈电子科技有限公司;Brucker Vector 33型傅立叶变换红外光谱仪,德国BRUCKER公司。

1.3 实验方法

1.3.1 试验设计

将所购买的新鲜牛里脊肉剥去表面的筋膜和脂肪,肉样切割为4 cm×4 cm×2 cm的牛肉块,并将其分装于食品级蒸煮袋中,最后将样品置于不同加热温度(60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120 ℃)的油浴锅中加热。分别测定其水分分布状况,各指标重复测定3次,分析牛肉在热加工过程中水分迁移规律。

1.3.2 指标测定

1.3.2.1 水分分布的测定

取每个样品中心位置约1 g的牛肉条分别装入直径为15 mm的核磁专用瓶内,将核磁瓶放置于磁体永久磁场中心位置。在肉样测定之前,首先利用分析软件FID(free induction decay)脉冲序列对系统参数进行校正,再利用CPMG(carr-purcell-meiboom-gill)脉冲序列采集样品横向弛豫时间(T2),重复测定3次。主要参数设置为:SF(MHz)=21,O1(Hz)=305 957.14,P90(μs)=13.00,P180(μs)=26.00,TD=74 990,PRG=1,TW(ms)=1 000.000,TE(ms)=0.250,NECH=3 000,SW(kHz)=100,RFD(ms)=0.080。

1.3.2.2 近红外光谱采集

通过傅立叶变换近红外光谱仪采集牛肉热加工过程中的光谱。采集光谱范围:10 000～4 000 cm-1(780～2 500 nm);扫描次数:64次;分辨率:8 cm-1。每个样品采集光谱3次,取平均光谱。

1.4 数据分析

每组实验数据重复测定3次,取平均值,采用SPSS 21.0软件完成数据统计,采用Origin 8.0软件绘图,在2D shige软件上进行二维相关分析。

2 结果与分析

2.1 不同加热温度下的牛肉横向弛豫图谱

牛肉在加热过程中蛋白质发生变性,进而产生一系列物理特性的变化,这会影响牛肉的水分分布情况。通过低场核磁共振的横向弛豫时间(T2)分析了牛肉加热过程中3种组分水的变化。图1是在不同加热温度下加热一定时间后牛肉的LF-NMR多组分弛豫图谱。

a-3 min;b-15 min图1 不同加热温度下加热3 min、15 min的牛肉T2分布图Fig.1 Distribution of beef T2at different heating temperatures for 3 min and 15 min

T2横向弛豫时间H质子自旋核在外加磁场收到射频脉冲的激发后,系统内部达到横向热平衡所需要的时间,其值越大反映水分子的流动性越强[15]。肉品在熟化过程中,核磁峰面积和峰形状都发生了显著变化。由图1可见,弛豫时间图谱出现3个核磁峰,从左至右分别对应:结合水1～10 ms(T21)、不易流动水10～100 ms(T22)、自由水100～1 000 ms(T23)。根据峰积分面积及其变化可知不同组分水的含量及迁移情况。T21表示的是一种存在于细胞内与大分子物质紧密结合的水,结构比较稳定。由图1可以看出,热加工过程中T21变化很少。T22代表不易流动水,又称半结合水,主要分布于肌原纤维及细胞膜之间。图1中T22峰峰面积、信号强度最大,说明牛肉中水分主要以不易流动水状态存在。随着加热温度升高,T22峰的峰高显著降低并且T22峰逐渐变宽;说明有一部分不易流动水会转化为游离的自由水。加热温度越高及加热时间越长,T22下降得越多。T23表示存在于细胞外间隙的水分,而鲜肉中没有自由水,随着加热温度不断升高,加热时间逐渐延长,自由水含量显著升高。结合水被看作是一种以氢键的形式与肌肉固形物相结合的强极性基团形成的单分子层水,半结合水是亲水基团周围的多层水及邻近水。蛋白质变性后,其特有的空间结构发生改变,局部呈现出不规则的线状结构[16]。环绕肽链周围单层水和多层水的形态也会发生变化。因此,3个核磁峰向左移动、驰豫时间都变短,这是由蛋白质和水分子之间的平均间距缩短所致。而牛肉在新鲜状态下及较低加热温度加热初期不存在T23峰,在80 ℃加热3 min的条件下,开始出现T23峰。并随着加热温度的升高,不易流动水向自由水转换的速率变快。

2.2 牛肉熟化过程中的近红外光谱分析

利用近红外光谱结合二维相关光谱研究牛肉熟化过程中的变化机理。由图2可知,不同加热温度下的牛肉光谱与鲜样相比出现显著的改变,如890、945、1 430、1 750、2 070 nm处反射值明显增大,鲜肉经热加工处理后出现原先没有的波峰,并且波峰和波谷都向长波方向移动。造成这些差异的原因是,牛肉在经过热加工处理之后,蛋白质热变性,其中的分子间作用力发生了改变,主要是氢键的含量发生了显著变化。当近红外光照射在样品上,样品内的含氢基团会选择性地吸收部分特定频率的近红外光,加热处理影响官能团中的O—H、C—H、N—H、S—H的基团振动特征改变,代表相关的分子结构发生变化[17]。

图2 牛肉不同加热温度下加热的原始近红外光谱Fig.2 Raw NIR spectra of beef heated at different heating temperatures

2.3 牛肉熟化过程中的二维近红外相关光谱分析

二维相关红外光谱技术将一维的近红外光谱在二维上展开,可以将重叠的小峰和弱峰清晰地显示出来,提高光谱的分辨率。同时该技术还能将官能团在外界干扰作用下的变化顺序在图中清楚地反映出来,从而有助于对牛肉肌肉熟化机理的研究。二维相关光谱中,在对角线上的峰为自动峰,总是正值;对角线外的峰为交叉峰,分为正交叉峰和负交叉峰。另外,图中显示区域,红色为正峰,蓝色为负峰[18]。

图3-a和图3-b为牛肉熟化过程中近红外光谱经二维相关分析得到的同步和异步谱图,不同加热温度的牛肉同步二维红外相关光谱主要在945 nm/945 nm、1 430 nm/1 430 nm附近出现了2个自相关峰,其峰强度依次为945 nm/945 nm>1 430 nm/1 430 nm,这2个自相关峰都是水分在近红外波段的吸收带,分别为O—H的四倍频振动和二倍频振动[19-20]。同时,在对角线外出现交叉峰,在890 nm/1 380 nm、1 380 nm/890 nm处出现正交叉峰,而890和1 380 nm处都是C—H伸缩振动,说明自相关峰光谱强度与牛肉熟度之间呈正相关[21]。此外还存在6个负交叉峰:945 nm/2 070 nm、2 070 nm/945 nm、1 430 nm/2 070 nm、2 070 nm/1 430 nm、1 750 nm/2 070 nm、2 070 nm/1 750 nm处,1750和2 070 nm处分别归属于S—H二倍频振动和N—H弯曲振动(称为酰胺II带),说明与牛肉熟度呈负相关。在图3-b中只检测到交叉峰,有4个正交叉峰,分别在890 nm/1 200 nm、890 nm/1 430 nm、890 nm/1 670 nm和890 nm/2 070 nm处。其强度依次为890 nm/1 430 nm>890 nm/1 200 nm>890 nm/1 670 nm>890 nm/2 070 nm。另外还有4个负交叉峰,分别在1 670 nm/890 nm、1 430 nm/860 nm、1 200 nm/890 nm和2 070 nm/890 nm处。根据Noda[22-23]规则,可以推断出牛肉熟化过程中不同官能团的变化时序为945 nm>890 nm>1 430 nm>2 070 nm>1 750 nm,即氢键变化时序为O—H→C—H→N—H→S—H。

a-同步二维近红外相关光谱图;b-异步二维近红外相关光谱图图3 不同加热温度下牛肉的同步和异步二维近红外相关光谱图Fig.3 Synchronous and asynchronous 2D NIR spectra of beef at different heating temperatures

2.4 近红外-核磁异质谱图分析

二维异质相关光谱常被用于检测2种不同光谱的共变特征。正相关说明2种不同光谱强度变化一致或存在相似来源。为深入探讨牛肉熟化过程中的官能团和水分变化的关系,得到了NIR光谱与核磁共振波谱之间的异质二维相关光谱图。

如图4-a异质相关谱图同步图所示,核磁驰豫时间大于100 ms的T23与NIR的1 430、1 685与2 050 nm附近形成3个较明显的正相关峰,表明合频O—H、二倍频C—H、二倍频O—H与自由水有相似来源;在图4-b异步图中,T23与NIR的945、1 430 nm附近有2个明显的正相关峰,四倍频O—H、合频O—H与自由水有相似来源,并且四倍频O—H比合频O—H优先变化;同时在这几处位置与T22附近同样有相应的负相关峰,说明加热使牛肉细胞内O—H、C—H等处的分子结构发生变化,牛肉细胞空间结构被破坏,细胞保水性变差,不易流动水不断向自由水转化并逐渐溢出细胞。

a-同步谱图;b-异步谱图图4 二维NIR/NMR异质相关光谱图Fig.4 Two-dimensional NIR/NMR heterogeneous correlation spectrum

2.5 牛肉熟化过程移动窗口二维相关光谱分析

扰动相关移动窗二维(perturbation related moving window 2D,PCMW2D)分析[24]将动态光谱变量与窗口大小为(2m+1)的子数据集中的动态扰动变量相关联。通过在整个扰动区域上移动窗口位置并计算每个窗口的相关函数,绘制映射谱图,就能获得沿扰动方向的光谱变化信息。此后Thomas等进一步发展了移动窗二维(moving window two dimensional,MW2D)相关光谱技术,2DCOS能够清晰地给出光谱变量之间的相关性和变化顺序。

采用移动窗口技术进一步揭示牛肉熟化过程中物质成分的变化过程,结果如图5所示。由图5-a中可以看出,牛肉加热3 min时,在945、1 430和1 750 nm处出现强的红外光谱峰,3个光谱峰分别是O—H四倍频振动,O—H二倍频振动和S—H二倍频振动。在加热时间延长至15 min时,同样的位置也出现了波谱峰,但其强度明显低于加热3 min时的波谱峰强度。在移动窗口H核磁共振谱图中,牛肉在加热初期(3 min),在加热温度70 ℃处出现2个核磁波谱峰,其波谱峰强度为55δ>65δ,两波谱峰分别代表半结合水和自由水,表明加热初期半结合水比自由水变化强度大;在加热后期(15 min)同样的化学位移处出现2个核磁波谱峰,但自由水的变化强度明显高于半结合水。根据Nada的二维光谱理论,自动峰的圆圈数越多,待测体系受外扰变化强度越大。上述结果说明,当温度达到70 ℃后,牛肉分子结构开始发生变化,分子间的氢键大量断裂,水溶性蛋白质开始凝固,牛肉细胞的保水性逐渐变差,细胞内的水分慢慢迁移到肉品的表面。80 ℃以后,由于对热敏感的分子结构已被改变,其他物质结构保持了相对稳定、变化缓慢。直到温度达到105 ℃左右,牛肉的近红外光谱和核磁谱又开始剧烈变化,在945和1 430 nm处又出现 2个 红外光谱峰,该峰分别是O—H四倍频振动和O—H二倍频振动。T23峰位置左移,游离水中H质子弛豫时间缩短。说明100 ℃ 以上的高温进一步破坏牛肉物质的分子结构。大量无序卷曲形成和大量疏水键暴露,导致肽链与水分子形成氢键的类型增加,蛋白质和水分子之间的平均间距缩短。110 ℃以后,物质结构的变化再次趋于缓和。高温对牛肉的影响将主要通过时间累积完成,这一发现与高温肉制品杀菌过程的经验认知相一致。

a-3 min移动窗口近红外光谱;b-15 min移动窗口近红外光谱;c-3 min H核磁共振谱;d-15 min H核磁共振谱图5 不同加热温度下牛肉的移动窗口近红外光谱和H核磁共振谱Fig.5 Moving window near-infrared spectra and H NMR spectra of beef under different heating temperatures

3 结论

基于CPMG序列测定牛肉在不同加热温度和时间下的横向弛豫时间T2,分析了核磁信号峰的参数。结果表明肉样中存在3种不同水分群,随着加热温度升高,时间延长,LF-NMR多组分弛豫图谱中代表不易流动水的峰面积减小,而自由水的峰面积随之增大。在峰形状上,T22峰高度明显降低,宽度增大;T23峰出峰后变宽;3个峰峰位置都显著左移。牛肉受热过程中NIR光谱变化特征是890、945、1 430、1 750、2 070 nm处,物质对近红外光吸收减少,反射值增高。

对不同温度下加热的牛肉进行了二维相关光谱和移动窗口分析,结果表明氢键光谱的变化时序为:945 nm>890 nm>1 430 nm>2 070 nm>1 750 nm,可以推断出牛肉熟化过程中不同官能团的变化时序为O—H→C—H→N—H→S—H。研究结果还显示,加热温度对牛肉分子结构的影响是非线性的,明显分为2个阶段。温度达到70 ℃后,核磁共振谱和近红外光谱都剧烈变化;温度达到100～110 ℃时,牛肉波谱再次剧烈改变。结合牛肉的物质结构可推知,70～80 ℃时对热敏感的分子受到影响,如水溶性蛋白质开始失活变性,半结合水发生迁移;但依然有大量基团保持了稳定。蛋白质空间结构直到100～110 ℃的高温才被进一步破坏,大量氢键断裂以及疏水基团暴露。这揭示了低温/高温肉制品分别选择70 ℃和110 ℃附近进行热处理的合理性。本文通过核磁共振和近红外光谱相结合的波谱技术,分析了肉品受热时的水分迁移及分子振动变化规律,为低温/高温肉品热加工技术提供科学参考。