杨雪媛 郝东

滨州医学院附属医院重症医学科，滨州 256600

脓毒症被定义为宿主对感染反应失调引起的危及生命的器官功能障碍。虽然现代医学技术发展迅速，对脓毒症的病理生理认识有了显著增加，但是目前除了抗感染和支持治疗，尚无特效治疗方法［1］。由于脓毒症晚期免疫细胞大量损伤死亡，导致免疫功能缺损或抑制，最后因器官衰竭和感染死亡。中性粒细胞占人类所有白细胞的50%～70%，是最早到达感染部位的细胞，是抵御感染的第一道防线的重要组成部分。脓毒症期间中性粒细胞的失调激活会影响其功能，包括迁移、吞噬、脱颗粒、活性氧和细胞因子的产生、中性粒细胞胞外陷阱（NETs）等［2］，所以评估脓毒症如何影响中性粒细胞功能的病理生理有助于发现治疗脓毒症的新策略。

中性粒细胞迁移受损

1.骨髓中性细胞的释放

生理状态下，中性粒细胞的产生和释放都受到严格的控制，只有1%～2%被释放到循环中［3］，中粒细胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF）和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF）刺激中性粒细胞的增殖、分化和活化。中性粒细胞的释放受到半胱氨酸-X-半胱氨酸趋化因子（cysteine-X-cysteine chemokine，CXC趋化因子）及其受体的严格控制，其中CXC趋化因子配体（CXC chemokine ligand，CXCL）12与CXC趋化受体（CXC chemokine receptor type，CXCR）4型介导中性粒保留在骨髓中，CXCL1/2与CXCR2介导中性粒细胞从骨髓中释放，但是脓毒症时骨髓CXCL12的表达下调，而CXCL1的表达增加，促进中性粒细胞从骨髓到外周循环的动员［4］。若脓毒症持续存在，循环中甚至可以出现中性粒细胞祖细胞，导致中性粒细胞“骨髓衰竭”，患者免疫功能受损，加重组织和器官损伤。

2.变形性和黏附作用的改变

中性粒细胞变形性是迁移和滚动的基础，血管内皮表达的E-选择素和P-选择素与中性粒细胞表达的L-选择素相互作用，L-选择素在中性粒细胞表面组成型表达并介导低亲和力黏附作用，中性粒细胞也表达出相对高水平的β整合素，细菌产物等可以上调其表达来响应炎症［5-6］。脓毒症时产生的细菌产物和促炎因子促进L-选择素的脱落并刺激中性粒细胞表面β整合素的表达，β整合素和血管内皮上的细胞间黏附分子-1和血管细胞黏附分子-1相互作用，介导与内皮细胞的高亲和力黏附作用［4，7］。脓毒症时促炎介质如肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α也可以通过刺激过氧化物酶增殖体激活受体γ（peroxidase proliferators activate receptor γ，PPAR-γ）介导f肌动蛋白（细胞骨架的主要构成成分）累积，降低细胞的变形性［8］。由于变形性的降低和高亲和力的黏附作用，中性粒细胞被阻隔在毛细血管床中导致血管闭塞加重，加剧组织缺血和器官功能障碍。

3.跨内皮迁移

甲酰甲硫酰基-亮酰基-苯丙氨酸（formylmethanesulfoyl-leucoyl-phenylalanine，fMLP）、血小板活化因子C5a、白三烯B4、白细胞介素（IL）8等与中性粒细胞表达的趋化因子受体结合介导中性粒细胞的定向迁移或趋化［3，9］。大多数趋化因子属于CC和CXC趋化因子亚家族，中性粒细胞表达CXCR1和CXCR2并对CXC趋化因子反应［10］。一些研究表明，脓毒症期间中性粒细胞迁移受损与循环中性粒细胞CXCR2表达下降有关，趋化因子长期或反复刺激配体激活G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptors，GPCR），将GPCR激酶（G protein-coupled receptor kinase，GRK）募集到细胞膜上，随后GPCR C末端的GRK磷酸化导致趋化因子以β-逮捕素和网格蛋白依赖性方式脱敏［11-12］。脂多糖（LPS）、磷壁酸和Toll样受体（TLR）2、4、9上调CRK2的表达来诱导CXCR2的内化［3，12］。一氧化氮（NO）和诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）可以导致中性粒细胞迁移受损。脓毒症时NO的增加会触发可溶性鸟苷酸环化酶的活化、蛋白激酶G磷酸化和环磷酸鸟苷形成，诱导中性粒细胞GRK2的表达，促进CXCR2的内化［3］。磷酸肌醇3-激酶γ（phosphoinositide 3-kinase gamma，PI3Kγ）信号通路被认为参与iNOS的二聚，Martin等［13］的实验证明脓毒症PI3Kγ-/-存活小鼠的CXCR2表达增加，GRK2表达降低，体外结果还证实，与CXCL2一起孵育的PI3Kγ-/-中性粒细胞显示CXCR2的内化降低，由此可见PI3K负调控CXCR2内化。中性粒细胞可以表达PPAR-γ，Reddy等［14］的研究证明PPAR-γ在中性粒细胞迁移中通过下调fMLP诱导的细胞外调节蛋白激酶-1/2（extracellular signal-regulated kinase-1/2，ERK-1/2）丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号转导途径的激活起到负调控作用。

细胞内抗菌性

LPS、脂蛋白、脂磷壁酸等均可以通过病原体相关分子模式与中性粒细胞上的TLR相互作用，识别并吞噬病原体，然后在吞噬溶酶体中将其消灭。中性细胞的抗菌活性主要有2个来源：（1）氧依赖途径。还原型辅酶Ⅱ（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）依赖性氧化酶介导产生超氧自由基以及其他次级衍生的活性氧。中性粒细胞受到刺激后，在吞噬体膜上组装完成NADPH，活性氧酶复合物将电子从NADPH上跨膜输送到电子受体分子氧，产生超氧离子和活性氧，在吞噬体中代谢为高度杀菌的最终产物，例如羟基自由基、过氧化氢和次氯酸等［15］。活性氧可以上调细胞因子及黏附分子的表达，该过程中，中性粒细胞耗氧量激增，可以达到正常值2～20倍，称为呼吸爆发［16］。（2）非氧依赖途径。主要是细胞内脱颗粒，中性粒细胞有4种胞浆颗粒：嗜天青颗粒、特异性颗粒、三级颗粒和分泌囊泡，颗粒中富含蛋白质，中性粒细胞诱导颗粒与吞噬体融合以消灭病原体［17］。在脓毒症时，炎症持续存在过度激活中性粒细胞生成大量活性氧，呼吸爆发产生的大量自由基损害线粒体功能，导致体内氧化还原反应失衡，对全身血管内皮细胞产生损害。

NETs

中性粒细胞也可以释放NETs来消灭病原体的DNA和抗菌蛋白网［18］。NET由中性粒细胞主动排出DNA、染色质和颗粒蛋白形成的原纤维组成，含有来自嗜氮颗粒的蛋白酶，例如中性粒细胞弹性蛋白酶、髓过氧化物酶和组织蛋白酶G；来自二级颗粒和三级颗粒的蛋白质，例如乳铁蛋白和明胶酶以及核蛋白［19］。NETosis是一种导致中性粒细胞NETs主动释放的细胞死亡方式，这种形式的细胞死亡依赖于NADPH氧化酶复合物，可通过蛋白激酶C方式诱发［20］。但Yipp等［21］研究数据表明，NETosis形成不一定导致中性粒细胞死亡。目前认为，NETosis有2种形式：（1）自杀性NETosis（suicidal NETosis）。细胞被裂解，脱缩的染色质参与构成的NETs被释放。（2）存活的NETosis（vital NETosis）。含有核DNA的囊泡通过出芽的方式释放NETs，细胞仍保持着完整性并具有正常的功能［20］。NETs能捕获微生物、限制微生物生长和抑制其散播，但脓毒症期间过度的NETosis诱导组织损伤及血栓形成［22］。NETs成分都被发现有促凝血的活性，如游离DNA可以激活内源性凝血系统，组蛋白可以通过血小板TLR2和TLR4相互作用直接诱导血小板聚集、诱导凝血酶的产生以及抑制抗凝血途径［23-24］。NETs黏附在血管内皮，以组蛋白和髓过氧化物酶依赖性的方式导致内皮损伤和器官损害，此外，组蛋白可以与损伤相关分子模式相互作用，通过髓系分化初级反应基因88信号传导通路促进促炎因子的产生［3］。在脓毒症时，体内各部位的中性粒细胞都可以产生NET，组蛋白的释放导致内皮细胞空泡化，导致肺泡内出血和其他组织损伤。

中性粒细胞死亡失调

1.凋亡

凋亡细胞被巨噬细胞吞噬以限制炎性反应，目前认为细胞凋亡有2条途径：（1）外在途径。由TNF家族的细胞外死亡配体信号与特定细胞表面的TNF受体相互作用介导的；（2）内在途径。细胞受到刺激，线粒体内部细胞色素c释放到细胞质中，激活半胱天冬酶形成凋亡体切割DNA和胞质结构蛋白［25］。中性粒细胞表达的髓系细胞白血病-1因子（myeloid cell leukemia-1，MCL-1）、B细胞淋巴瘤因子（B-cell lymphoma-extra large，Bcl-xL），膜联蛋白A1，Bak均是Bcl-2家族抗凋亡因子，从脓毒症患者分离的中性粒细胞检测到MCL-1水平升高，MCL-1的累积可防止线粒体内膜释放细胞色素c以及细胞凋亡诱导因子。因此，MCL-1是通过保护线粒体跨膜点位来调节内在凋亡途径的［25-26］。在脓毒症期间，外周循环中LPS和补体C5a等促炎介质可以诱导ERK-1/2和磷酸肌醇-3激酶活化，进一步诱导AKT磷酸化和随后的Bad磷酸化，抑制线粒体释放细胞色素c，从而抑制凋亡体形成；LPS还可以使髓系核分化抗原的重新定位和切割受损，并防止MCL-1的蛋白酶体降解，从而致使中性粒细胞凋亡延迟［3］。Li等［27］的研究表明，脓毒症中由糖酵解酶丙酮酸激酶M2介导中性粒细胞程序性死亡受体-1（programmed death-1，PD-1）上调来拮抗中性粒细胞凋亡，此外半胱天冬酶3、9的抑制以及CD24的下调均参与了细胞凋亡的抑制。中性粒细胞的累积有利于病原体的清除，但大量中性粒细胞长期浸润会导致持续的组织损伤。

2.焦亡

焦亡是半胱天冬酶依赖性的调节性细胞死亡方式，目前认为焦亡主要有2种途径：（1）半胱天冬酶-1依赖性经典途径。细胞内Nod样受体家族识别病原体和其他的信号，例如炎性小体，通过衔接蛋白凋亡相关斑点样蛋白（ASC）与半胱天冬酶-1原结合激活酪蛋白酶-1，被激活的半胱天冬酶-1切割促炎因子gasdermin D（GSDMD），GSDMD的N端和细胞膜上的磷脂酰肌醇结合形成“gasdermin通道”释放内容物诱导炎症，活化的半胱天冬酶-1也可以切割前IL-1β和原IL-18转换为IL-1β和IL-18诱导炎症。（2）半胱天冬酶-4/5/11依赖性非经典途径。LPS的脂质A可以直接与半胱天冬酶活化的N端结合，并结合半胱天冬酶4/5/11的募集结构域诱导其寡聚化，被激活的半胱天冬酶4/5/11裂解GSDMD并诱导其焦亡，同时诱导半胱天冬酶-1裂解IL-1β和原IL-8转换为IL-1β和IL-8［28-29］。中性粒细胞焦亡后，大部分受损的细胞器与细胞骨架和细胞残体联系在一起形成孔诱导的细胞内陷阱，将细菌留在细胞残体内进行二次吞噬杀伤或者募集中性粒细胞释放活性氧进行杀伤［30-31］。但是Chen等［32］的研究表明，中性粒细胞和经典炎症小体信号转导蛋白ASC中的半胱天冬酶-1低表达，GSDMD不能被有效切割，导致中性粒细胞不依赖经典途经的局灶性死亡，但是该过程释放IL-1β，会招募更多中性粒细胞。当宿主被病原体感染时就会有焦亡发生，细胞膜破裂以及促炎因子的释放阻断病原体的复制并招募免疫细胞消灭病原体，但是过度的焦亡会产生过多的促炎因子，引起失控的炎性反应，加速脓毒症的进程。

3.自噬

自噬是由自噬相关蛋白（autophagy-related protein，ATG）调控的自我降解的过程。自噬对中性粒细胞起双向调节作用，其一，中性粒细胞自噬体形成后与溶酶体融合分解清除胞内坏死物质，维持中性粒细胞氧化应激状态下的生存；其二，自噬体也可以激活凋亡蛋白加速细胞死亡［33］。脓毒症时可以有多个靶点来诱导自噬，例如LPS与TLR4结合通过MAPK/p38信号轴激活自噬；LPS也可以通过影响核因子κB来激活自噬；而磷脂壁酸与TLR2结合通过MAPK1/ERK-2-MAPK3/ERK-1途径诱导自噬［28，34］。由研究发现自噬和NET诱导与PI3K-AKT-mTOR轴相连，阻断自噬体形成的PI3K Ⅲ型信号通路可以抑制NETs形成，敲除ATG5的基因会导致自噬缺陷，但不会导致NETs形成缺损，由此推断自噬不是NETs形成的必要条件［25］。另一项研究发现，LPS干预的自噬缺陷中性粒细胞会导致其迁移抑制因子分泌增加并加重炎症［35］。自噬是机体应激反应的一部分，可以通过减少细胞因子的释放控制炎症，但是自噬紊乱会导致炎症失控。

总结与展望

脓毒症早期，中性粒细胞动员增加并凋亡受损，导致其在循环中大量累积，到脓毒症晚期，大量幼稚中性粒细胞释放到循环中导致骨髓耗竭，且幼稚的细胞无法有效清除病原体，加之中性粒细胞迁移受损，致使无法有效控制感染。此外，中性粒细胞死亡失衡导致组织损伤和器官衰竭进一步加重。在多种机制的共同作用下，脓毒症患者免疫系统受到抑制，血栓形成增加甚至出现弥散性血管内凝血。因此，探索中性粒细胞在脓毒症中的功能的病理生理有助于找到治疗的新靶点。有研究发现脓毒症中髓源性抑制细胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSCS）上调以及幼稚中性粒细胞增多会导致免疫抑制［36］。Wang等［37］研究表明，中性粒细胞上程序性死亡配体-1（PD-L1）表达增加加速细胞凋亡，以驱动肺损伤并增加临床和实验中败血症的病死率，所以抑制MDSCS的表达和促进细胞成熟及释放以及抗PD-1/PD-L1抗体治疗可以改善脓毒症者预后。此外GM-CSF、G-CSF也开展了临床试验，这些治疗手段都已经取得了不错的效果。

作者贡献声明杨雪媛：起草文章；郝东：对文章的知识性内容作批评性审阅，行政、技术或材料支持，指导