王 朝 赵 煜

[1.天津市儿童医院（天津大学儿童医院）天津市儿科研究所 天津市儿童出生缺陷防治重点实验室，天津 300134；2.天津市儿童医院（天津大学儿童医院）消化科，天津 300134]

在感染性疾病的治疗中，抗菌药物一直发挥着不可替代的重要作用，但由于不合理用药的出现和持续，很多病原菌发生抗药性变异，抗菌药物的杀灭或抑制作用逐渐降低，甚至丧失，使感染性疾病的治疗面临重大挑战。在细菌抵抗抗菌药物作用的过程中，除基因的抗药性变异外，表型变异导致的持留菌也扮演着重要角色。持留菌是细菌在抗菌药物等环境压力下出现的极小一部分可以耐受环境变化并生存下来的细菌亚群，这类细菌在基因上并未发生变异，在环境压力去除后继续生长繁殖所形成的新菌群会保持与最初菌群相同的抗菌药物敏感性[1]。持留菌会使感染性疾病迁延不愈，加大了临床治疗难度，但目前专门针对持留菌的药物少之又少。本文对近年来有关持留菌形成机制和清除策略的研究进行综述。

1 持留菌的形成机制

细菌的持留现象很早就被发现，但其发生、发展机制目前尚不完全清楚。根据形成原因，持留菌可分为诱导形成和自发形成两大类。诱导形成即特定环境压力导致的持留菌形成；自发形成指即使在非压力环境下，仍有一定比例的持留菌形成[1]。已知的一些细菌生理或耐药机制与持留很相似，其中最主要的就是细菌休眠和靶标失活，但这2种机制或现象并不能完全解释持留菌的复杂生理机制。与作为“被动防御”的休眠相比，持留其实是一种增强药物外排作用的“主动防御”[2]。例如，细胞内的金黄色葡萄球菌持留菌保持代谢活性，并产生与某些应激反应一致的转录产物[3]。持留现象属于低频表型变异，且具有高度异质性，其形成与细胞生理的很多基本过程有关，包括但不限于能量代谢、复制、转录、翻译、胞内药物浓度和防御机制[4]。持留菌的形成也与饥饿、宿主免疫和抗菌药物的频繁刺激等宏观环境有关，并能从进化角度进行阐释[5]。持留菌在上述不同层面的变化会体现在细菌不同的生理通路或分子机制中。

1.1 细菌毒素-抗毒素（toxin-antitoxin，TA）系统

TA系统是一类丰富的基因元件，编码一类能够抑制细胞生长的毒素（蛋白质或RNA）和一类能够抵消毒素作用的抗毒素。大多数毒素是干扰DNA复制或翻译的酶，但也有各种各样的活性分子和细胞靶标。抗毒素也是由蛋白质或RNA构成的，单独或者与其他信号元件一起对TA系统的转录或翻译进行调节，进而控制同源毒素。根据抗毒素的性质和抑制毒素的方式，TA系统可分为多种类型[6]。在对结核分枝杆菌的研究中，一种Ⅱ型TA系统被认为可能发挥持留菌形成的分子开关的作用，有望成为开发更短、更有效的结核病治疗方案的药物靶点[7]。有研究者在金黄色葡萄球菌中发现了一种I型RNA抗毒素SprF1，可以通过结合核糖体减弱翻译促进持留菌的形成[8]。有研究在铜绿假单胞菌中鉴定出一种通过减少烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）的方式促进持留菌形成的新的TA系统，其编码基因分别为PA14_51010和PA14_51020[9]。有研究者对Hip激酶进行了全面的分析，发现了7个新的激酶家族，扩展了这一家族的多样性，为Hip激酶超家族的研究开辟了新途径[10]。

1.2 应激反应

目前，大多数研究都集中于众所周知的应激反应，如饥饿、SOS应激反应、活性氧（reactive oxygen species，ROS）和DNA损伤。由于静止期持留菌水平的增加，许多研究者认为，饥饿、饥饿诱导的应激反应和其信号素鸟苷酸四（五）磷酸[guanosine pentaphosphate or guanosine tetraphosphate，（p） ppGpp]是持留菌发生、发展的依赖因素。（p） ppGpp水平的升高会使翻译停止，使复制受到抑制，并通过促进RNA聚合酶的回溯参与DNA修复。缺乏relA的突变体通常由于（p）ppGpp水平降低或应激反应改变而出现较低水平的持留现象[11]。SOS应激反应的失活或DNA修复机制的损伤会降低持留水平[12]。低水平的DNA损伤只在能够触发SOS应答的菌株和经历轻度SOS诱导的细胞中增加持留水平。大肠埃希菌在静止期，持留菌只见于某种处理后出现于恢复期的功能性SOS应答和DNA修复过程[12]。提示持留的发生依赖于SOS应激反应，也依赖于功能正常的DNA修复机制。ROS是免疫系统清除体内细菌的重要因子，杀菌类抗菌药物的致死作用有少部分源于ROS，此类抗菌药物通过刺激呼吸和消耗主要在三羧酸循环中形成的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）来诱导ROS的形成，因此ROS很有可能也参与了持留菌的形成。在鲍曼不动杆菌中，群体感知依赖的持留诱导也会导致产生对抗ROS的物质，如过氧化氢酶和超氧化物歧化酶的增加，考虑到进入静止期后持留菌会增加。有研究者将注意力集中在群体感应和细菌间的通信上，发现铜绿假单胞菌产生的铜绿菌素在鲍曼不动杆菌中表现出跨菌种持留诱导[13]。这表明在自然微生物环境中，群体感应和细菌间通信诱导的持留现象可能比预想的更为普遍。

1.3 生态学与持留菌形成

无论是在不同物种之间，还是在同一物种的不同菌株或分离物之间，细菌的持留水平在自然界中均有很大的差异[14]，造成这种差异的原因仍然是一个有争议的问题。VAN等[15]认为，持留是由进化精心设计和塑造的用以抵御不利条件的特殊策略，它是生命过程中不可避免的“副作用”。目前尚缺乏关于持留菌应对抗菌药物治疗的演变实验数据，但是可以从押注对冲策略和社会学角度对其进行阐释。

1.3.1 押注对冲策略

押注对冲策略是生物体应对环境变化的种群水平策略。种群中一定数量的个体向不同表型转换，每种个体都适应1种未来可能出现的环境。由于存在次优变异体，种群的平均适应度会降低，但却在时间上优化了适应性，这种策略如同经济学领域的投资策略——不要把所有的鸡蛋放在1个篮子里。在几乎所有的生命形式中都存在这种押注对冲策略。这些变异在难以预测或极端情况下对生命自身是有利的。持留菌的某些特性使其成为押注对冲策略的教科书式范例，不仅见于多种抗菌药物暴露的情况，也见于更普遍的酸、氧化、高温、DNA破坏剂、盐度、金属离子、胆汁酸、辐射或噬菌体等应激条件[15]，使持留菌能够保证种群免于灭绝。有研究者通过优化控制理论将生物种群动态研究和金融风险管理数学相结合，在理论上证明了持留现象是一种最佳的对冲策略[16]。体外实验中，当经历不太频繁的抗菌药物治疗时，大肠埃希菌种群持留水平与连续治疗之间的无药期长度成反比；停止治疗后，之前的高持留水平又缓慢下降，这与持留现象的数学对冲模型所预测的结果一致[17]。这些结果表明抗菌药物治疗可以促进持留菌的进化。

1.3.2 社会特性

在更广阔的生态环境中，除了押注对冲策略外，持留性也可以被视为一种社会特性。完全相同个体的大量繁殖会加剧细菌对相同资源的竞争，而持留菌的出现则可以缓解这种竞争。接触依赖性生长抑制（contact-dependent growth inhibition，CDI）可以诱导克隆细菌群体产生高水平的持留菌，可以认为CDI系统介导了一种种群密度依赖的押注对冲策略，这可能是CDI系统提高宿主适应性的机制之一[18]。以这种方式来看，持留也可以被看作是一种合作的、社会性的特征，它受到亲缘选择的影响，并导致亲缘选择。然而，这一理论仍有待全面的实验检验和探索。

1.4 突变的影响

需要注意的是，除了上述环境诱发因素外，所有类型的持留水平都可能因基因突变而增加或减少。当然，这种突变是与持留表型相关的突变，而不同于抗药性突变。很多能够增加持留或耐受性的突变已被发现，如最早发现的高持留突变——hipA7突变可以使大肠埃希菌的触发型持留水平增加多个数量级，达到整个种群数量的约20.0%，而野生型菌株的持留水平通常低于0.1%[1]。有研究结果显示，细胞染色体倍性是氟喹诺酮类药物所致持留菌的重要决定因素，二倍体大肠埃希菌持留水平明显高于单倍体大肠埃希菌[19]。另外，表观遗传学变异，如甲基化改变，也被发现与持留菌形成有关[20]，这为持留菌的研究打开了新的视角。

1.5 细胞衰老

细胞衰老也可能导致同基因种群的变异。细胞内容物的非对称分裂使其具有不同特性，细菌衰老概念假设细胞分裂为1个相对幼稚子代细胞和1个相对衰老子代细胞，而基本上任何细胞化合物的不对称分布都可能产生表型变异。一般认为，衰老的细胞会遗传更多受损的物质，如氧化蛋白和受损的DNA，导致生长缓慢。衰老过程中的表观遗传会导致细胞更倾向于产生衰老的子代细胞，衰老细胞的积累将导致静止期持留水平的增加。有实验观察结果支持衰老诱导持留的假设，研究者采用微流控技术发现在耻垢分枝杆菌中，衰老细胞的存活率反而更高[15]，清楚地表明了细胞衰老在抗菌药物耐受中的作用。

2 清除策略和方法

2.1 直接杀灭

抗菌药物通过破坏特定的、必需的大分子靶标的正常功能来杀死细菌。根据持留菌的特性，直接杀灭持留菌的化合物必须针对干扰去极化，或破坏细胞膜、DNA交联，或抑制必需酶，或产生ROS等过程。目前尚处于研究阶段的对持留菌有直接杀灭或抑制作用的药物见表1。此外，在新型分子生物材料的帮助下也可以实现“老药新用”，一种全新设计的抗结核肽和由透明质酸组装而成的“气凝胶”被证明可以有效地结合和清除结核分枝杆菌持留菌[29]。

表1 部分尚在研究阶段的对持留菌有直接杀灭或抑制作用的药物

持留菌实际上是由几个对1种或一小群特定抗菌药物有耐药性的细菌亚群组成的，因此不同种类抗菌药物制剂的组合可以形成多目标攻击，从而有效地杀灭不同的耐药细菌亚群。在鲍曼不动杆菌感染的治疗中，黏菌素和阿米卡星联用是最有效的根除持留菌的方法[30]。黏菌素和环丙沙星联用对根除铜绿假单胞菌持留菌具有较好的效果[31]。联合使用对新陈代谢有强烈和微弱依赖性的2类抗菌药物可以高效清除持留菌[32]。这种对已知药物进行重新组合再利用的方法可以减少药物研发成本和时间。

有趣的是，一些已知的非抗菌药物被发现具有抗持留菌效果。一些抗癌药物最近被证明具有强大的抗持留菌活性。索拉非尼衍生物SC5005在清除包括生物膜内的金黄色葡萄球菌持留菌方面表现出优越的活性[33]。DNA交联剂丝裂霉素C能有效杀死鲍曼不动杆菌和伯氏疏螺旋体等几种重要病原菌的持留菌[34]。虽然现有抗癌药物的跨领域再利用有多种优点，但其较大的副作用和较高的毒性会影响其抗持留菌的临床应用。此外，有研究利用深度学习的方法进行筛查，发现为治疗糖尿病研发的海利霉素可能是一种广谱抗菌药物，对多种病原具有杀灭作用，并能根除大肠埃希菌持留菌[35]。

2.2 致敏或复苏持留菌

致敏持留菌主要包括刺激抗菌药物靶标和刺激抗菌药物内流泵，如L- 丝氨酸等代谢产物能够增强大肠埃希菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的持留菌对庆大霉素的敏感性[36]。有文献提示，毒素或能诱导持留菌复苏，某些TA系统有介导解毒作用，如抗毒素MazE的表达可以中和MazF诱导的持留菌[37]。复苏持留菌也可以通过非抗毒素途径实现，这些途径可以逆转毒素对细胞生理的影响，而不是直接抑制毒素本身，如乙酰化的tRNA被肽基tRNA水解酶Pth脱乙酰，有助于恢复持留菌的生长[38]。有单细胞观察实验结果表明，持留菌还可基于核糖体含量而复苏，核糖体含量越高，持留细胞复苏的速度就越快[39]。最新的研究发现，可诱导持留形成的毒素HokB在特定条件下同样可以诱导持留菌复苏[4]，这一机制给持留菌复苏相关研究提供了一些新提示。

2.3 减少持留菌形成

消除现有的持留菌可以大大提高慢性感染的治疗效果，而在抗菌药物治疗之前抑制或消除其形成则有可能预防慢性感染。有学者对持留菌形成机制进行了深入研究，发现了促进几种干扰持留形成从而减少持留菌数量的方法，如抑制铜绿假单胞菌中的群体感应调节子MfvR可以减少持留菌的形成[40]。一种合成的二萜类似物4-（4，7-二甲基-1，2，3，4-四氢萘-1-基）戊酸可以通过靶向（p）ppGpp合成酶抑制分枝杆菌持留菌和生物膜的形成[41]。目前，许多TA系统已被发现与持留菌相关，寻找毒素抑制剂亦不失为一种好方法。基于结构学原理从HipA抑制剂中筛选出的类似物，在与氨苄西林和卡那霉素联用后，进一步降低了大肠埃希菌的持留水平[41]。由于蛋白质应激是持留菌形成的原因之一，通过使用渗透剂等辅助手段来限制蛋白质的聚集，也能降低大肠埃希菌的持留水平，并可使持留菌对一些抗菌药物敏感[42]。

3 总结和展望

目前已知的绝大多数细菌均可产生持留菌，且持留菌不仅能促进抗性突变，还可以促进抗性质粒的传播。可以推测，临床感染性疾病，尤其是慢性感染性疾病中广泛存在持留菌，这是复发感染和迁延不愈的重要原因，其潜在危害不容忽视。持留菌与种群中的其他细菌在遗传上是相同的，并且在环境压力（如抗菌药物）诱导下的表型只是暂时的，这更加重了持留菌研究的难度，需要更多的研究者将注意力集中于此，以促进阐明持留菌形成机制，寻找抗持留菌方法，研发相关药物。这将有助于解决目前出现的抗菌药物临床应用危机，给感染性疾病的治疗带来广泛而深远的影响。