HPLC法测定食品中脱氢乙酸含量的方法优化

2023-11-07范灵慧

食品工业 2023年10期

范灵慧

上海源本食品质量检验有限公司（上海 200090）

脱氢乙酸，固态为白色或略微淡黄色具有结晶性的颗粒状粉末，无臭、没有任何气味、熔点108～110℃，沸点270 ℃，是一种具有低毒、高效的防腐、防霉剂。在酸、碱等环境下具有一定的抗菌功能，特别是对霉菌的抑制作用最强[1]。它通常是一种有效的消毒剂。但是过量服用会对身体产生一定的危害。我国允许在部分食品中添加使用。GB 5009.121—2016《食品安全国家标准食品中脱氢乙酸的测定》中脱氢乙酸的液相色谱法前处理过程较为复杂，不同基质处理方法不同，进样后色谱峰拖尾严重，此次试验在国标基础上进行简化，优化流动相比例和不同基质的前处理方法，使实验操作更简单且峰型更对称。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

液相色谱仪Ultimate3000（赛默飞世尔科技有限公司）；电子天平BSA 423S（德国赛多利斯公司）；超声波清洗器FXP 20M（Unisonics Australia）；涡旋震荡混合器BE-2600（其林贝尔仪器制造有限公司）；实验室pH计FE20[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]。

乙酸铵[默克化工技术（上海）有限公司]；氢氧化钠（永华化学股份有限公司）；硫酸锌（上海凌峰化学试剂有限公司）；甲醇（色谱纯，美国默克公司）；氨水（永华化学股份有限公司）；超纯水（上海和泰仪器有限公司实验室超纯水机制得）；0.45 μm水相滤膜（上海安谱实验科技股份有限公司）；脱氢乙酸（dehydroacetic acid）标准品（BePure，纯度大于99.9%）。

标准储备液：准确称取0.050 g脱氢乙酸标准品，用20 g/L的氢氧化钠溶液溶解后用水定容至50 mL，配制成质量浓度1.0 mg/mL的标准储备液。

标准工作液：标准储备液经逐级稀释后，配制成1，10.0，50.0，100和200 μg/mL标准工作液质量浓度。检测用食品：市场流通渠道购买。

1.2 仪器工作条件

色谱柱DikMA Silversil 5 μm C18，250 mm×4.6 mm；柱温35 ℃；进样量10 μL；流速1.0 mL/min；检测波长293 nm；进样时间22 min；流动相为乙酸铵溶液（0.02 mol/L）-甲醇，洗脱比例见表1。

表1 脱氢乙酸流动相梯度洗脱比例

1.3 样品前处理

称取2 g试样于50 mL玻璃比色管中，加入25 mL超纯水，旋涡混合1 min，超声提取30 min以上，取出后再次涡旋混合1 min，加入5 mL的ZnSO4溶液（120 g/L），用NaOH溶液（20 g/L）调节pH 7.5，用水定容至50 mL，摇匀，用滤纸过滤，取澄清滤液，过0.45 μm的水相滤膜后上机测定。

2 结果与讨论

2.1 前处理中蛋白沉淀剂的选择

分别对常用的无机沉淀蛋白体系，即亚铁氰化钾和乙酸锌、亚铁氰化钾和硫酸锌、氢氧化钠和硫酸锌进行加标回收试验。结果表明，在3种沉淀体系中氢氧化钠与硫酸锌沉淀法的回收率最高，故试验选用氢氧化钠和硫酸锌作为蛋白沉淀剂。

2.2 色谱操作条件的确定

2.2.1 检测波长的确定

使用DAD检测器，在3D光谱图上读取到脱氢乙酸吸收峰最大时候的波长分别在230 nm和293 nm处，但是在230 nm处时，杂质干扰多，在293 nm处杂质干扰少，故选取检测波长293 nm，与国标方法波长一致。

2.2.2 流动相梯度洗脱比例

脱氢乙酸抗酵母菌和霉菌的效果较好，因此被广泛应用于面包、糕点和发酵食品中，由于这些食品中经常会同时添加各种类型的添加剂，为使样品中性质差异较大的组分能达到良好的分离效果，以及洗脱干净的目的，试验采用梯度洗脱。洗脱比例见表1。

2.2.3 流动相pH的选择

在相同的仪器条件下，对质量浓度50.0 μg/mL的脱氢乙酸标品进样后对比图谱。使用GB 5009.121—2016《食品安全国家标准食品中脱氢乙酸的测定》中方法，0.02 mol/mL乙酸铵-甲醇9∶1（体积比）流动相进样图谱如图1所示。试验将0.02 mol/mL的乙酸铵用氨水调节pH 9.0，初始流动相比例为甲醇-0.02 mol/mL乙酸铵1∶49（体积比），并采用表1梯度洗脱，进样图谱如图2所示。

图1 0.02 mol/mL乙酸铵与甲醇9∶1（体积比）流动相进样图谱

图2 用氨水调节pH的0.02 mol/mL乙酸铵与甲醇1∶49（体积比）进样图谱

由图1和图2的图谱对比可看出，使用试验优化后的流动相进样，得到的脱氢乙酸色谱峰的峰型和对称性较好。

2.3 线性关系

标准品质量浓度在1.0～200.0 mg/mL的质量浓度范围内响应值好，峰面积的线性关系良好，线性方程y=0.482 8x，相关系数R2=0.999 7。见表2。

表2 脱氢乙酸检出限、定量限及线性方程

2.4 回收试验

2.4.1 国标法与试验优化方法回收率比较

根据GB 5009.121—2016 《食品安全国家标准食品中脱氢乙酸的测定》第二法液相色谱法中12.1试样制备与提取可知，国标法对不同的基质有不同的前处理方式。试验简化后的前处理方法则可统一处理不同基质的样品，选用果蔬汁、腐乳、糕点和黄油作为试验基质加入脱氢乙酸标准品，分别按照国标方法和试验方法前处理后进样，对比它们的加标回收率，结果见表3。

表3 不同基质样品不同前处理方法回收率

2.4.1.1 果蔬汁

按国标方法称样在离心管中，需要调pH后转移到容量瓶中定容，置于离心管中离心取上清液调节pH后再次定容，取5 mL过固相萃取柱，收集洗脱液后上机测定，在该前处理过程中，反复的转移和过固相萃取柱都会造成损失。而试验优化后的前处理直接称样在比色管中，加入沉淀剂后用比色管定容即可，减少反复转移和固相萃取柱净化的步骤，可以提高回收率。由数据结果也可得出国标方法回收率较优化后方法低。

2.4.1.2 腐乳

按国标方法称样在离心管中，转移到容量瓶中定容，超声提取后过滤上机，回收率达99%，试验前处理优化后回收率也达100%，在回收率相差不大的情况下，试验的前处理过程更为简单和方便。

2.4.1.3 糕点

按国标法称样溶解加入沉淀剂定容后需要转移至分液漏斗中，用正己烷重复抽提后取水相层离心，取上清液过滤膜测定，若高效液相色谱分离效果不明显，需要取上清液调节pH后过固相萃取柱，洗脱后再上机。从表3可知，通过国标法萃取后，回收率已较低，过固相萃取柱之后损失更大，而用试验优化后的前处理方法，回收率较好。

2.4.1.4 黄油

根据国标法需要用正己烷抽提后离心上机，若分离效果不佳再过固相萃取柱净化，试验国标法回收率达103%，但是过固相萃取柱之后回收率为98%，而试验回收率为109%，虽然操作便捷，但是试验优化后减少去油脂的步骤，对油脂含量高的食品检测结果影响较大，故回收效果不如国标方法。

因此，试验优化后的前处理方法适用于大部分的基质样品，进样后分离度好，且回收率高。国标方法若是分离效果不明显需要再次过固相萃取柱，造成较大损失。但当样品为油类基质时，更推荐使用国标法。

2.4.2 方法优化后回收率与精密度

选取蔬菜汁、腐乳、糕点样品，按定量限的3，5和10倍范围进行加标回收，故分别在0.015 0，0.025 0和0.050 0 g/kg三水平添加脱氢乙酸，按优化的前处理方法进行提取和测定，每个添加水平平行测定6次，计算回收率和精密度。试验结果表明，测得的平均回收率范围为97.1%～104.0%，SRSD在0.34%～2.32%。测定结果见表4。