朴松哲 蔡仙国 柯莽 郑兰 周高波 陈超前

肾癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤之一。肾透明细胞癌（kidney renal clear cell carcinoma，KIRC）是肾癌最常见的病理类型，约占80%，细胞组织形态学特征表现为细胞内脂滴积聚。N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine,m6A）修饰是近年来肿瘤领域研究的热点，研究表明m6A 修饰是真核细胞中丰度最高的RNA 修饰方式，参与基因表达调控中的多个环节，如RNA 剪切、成熟、出核、翻译及降解，并影响多种生理、病理进程，如胚胎发育、代谢稳态维持和肿瘤发生、发展。越来越多的研究显示m6A 修饰在肾癌，尤其是KIRC 演进过程中发挥重要作用。Wang 等[1]发现在KIRC 中抑制甲基转移酶（methyltransferase，METTL）14 基因表达可以诱导肿瘤生长，且METTL14 mRNA 高表达患者总生存期（overall survival，OS）较低表达患者明显延长。Li等[2]发现METTL13 基因和蛋白在KIRC 组织中呈低水平表达，敲低METTL3 可明显促进肾癌细胞增殖、迁移和侵袭功能，并诱导肾癌细胞发生G0/G1细胞周期停滞。然而烷烃羟化酶同源5 基因（alpha-ketoglutarate-dependent dioxygenase homolog 5，ALKBH5）在KIRC 中的相关研究较少。最新研究发现，ALKBH5 作为m6A 去甲基化酶与肾癌代谢重编程和肿瘤细胞线粒体含量调节有关[3-4]。本研究利用生物信息学探讨ALKBH5 mRNA 和蛋白在KIRC 组织中的表达情况，分析ALKBH5 与KIRC 患者临床病理特征及预后的关系，以期为寻找KIRC 新的治疗靶点提供理论基础和依据。

1 材料和方法

1.1 数据获取 本研究基于肿瘤基因组图谱（the cancer genome atlas，TCGA）数据库与基因型和基因表达量关联数据库（genotype-tissue expression，GTEx）数据库。登陆UCSC Xena 数据库（http://www.xebabrowser.net），下载经Toil 流程[5]统一处理的KIRC（531 例KIRC组织和72 例癌旁组织）、肾乳头状细胞癌（kidney papillary renal cell carcinoma，KIRP）（291 例KIRP 组织和32例癌旁组织）及嫌色细胞癌（kidney chromophobe renal carcinoma，KICH）（66 例KICH 组织和25 例癌旁组织）项目的转录组测序（RNAseq）数据、患者临床病理参数和OS 资料；登陆GTEx 数据库，下载28 例正常肾组织RNAseq 数据。

1.2 表达差异分析 利用R 软件（V4.0.0）“limma”和“ggplot2”程序包比较KIRC 组织和癌旁组织中ALKBH5 mRNA 表达水平。应用阿拉巴马大学伯明翰分校癌症数据分析数据库（the University of Alabama at Birmingham cancer data analysis portal，UALCAN）（http://ualcan.path.uab.edu/ index.html）分析KIRC（110 例）和癌旁组织（84 例）中ALKBH5 蛋白的表达水平。

1.3 临床信息分组 根据TCGA 数据库中KIRC 患者临床资料对患者分组，去除无意义、缺失或重复的数据，根据年龄分为≤60 岁（271 例）和＞60 岁（275 例）；根据性别分为男（355 例）、女（191 例）；根据种族分为白人（474 例）和有色人种（亚裔+非洲裔，65 例）；根据美国癌症分期联合委员会（American joint committee on cancer，AJCC）2007 分期分为Ⅰ～Ⅳ期，其中Ⅰ期276例，Ⅱ期59 例，Ⅲ期125 例，Ⅳ期83 例；根据组织学分级分为G1～G4级，其中G1级14 例，G2级238 例，G3级208例，G4级78 例。登陆UALCAN 数据库，根据KIRC 分子亚型分为A 亚型（205 例）和B 亚型（175 例）[6]。酵母交换型转换/蔗糖不发酵（yeast switch in mating type/sucrose non fermentation，SWI/SNF）是一种ATP 依赖的染色质重塑复合物，SWI/SNF 染色质重塑复合物缺陷被认为与肾癌的发生、发展密切相关[7-9]。根据SWI/SNF染色质重塑复合物是否突变分为突变组（98 例）和未突变组（84例），并比较两组ALKBH5蛋白的表达水平。

1.4 ALKBH5 mRNA 表达水平对KIRC 患者预后的影响 从UALCAN 数据库获取KIRC 患者信息，去除正常组织、无临床信息及重复的数据，根据ALKBH5 mRNA 中位表达水平分为高、低表达组；按性别将KIRC 患者分为不同亚组（男性高表达组和男性低表达组、女性高表达组和女性低表达组），对不同亚组进行生存分析，采用log-rank 检验比较不同组间的生存率。

1.5 基因文库富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA） 使用LinkedOmics 数据库（http://www.linkedomics.org/login.php）的LinkFinder 模块分析TCGA 数据库KIRC 队列（479 例）中与ALKBH5 相关的差异表达基因。结果采用Spearman 秩相关分析。使用Linked-Omics 的Link-Interpreter 模块对差异表达基因进行通路和网络分析。采用GSEA 对LinkFinder 结果数据进行基因功能富集分析，显著富集的阈值为错误发现率（false discovery rate，FDR）＜0.25 且P＜0.05。

1.6 统计学处理 使用R（4.0.3）软件，分别使用ggplot2（3.3.6）、stats（4.2.1）、car、pROC（1.18.0）、survival用于统计和图形分析。非正态分布的计量资料采用Mann-WhitneyU检验或Kruskal-WallisH检验进行组间比较，绘制ROC 曲线评估ALKBH5 mRNA 表达水平对KIRC、KIRP 和KICH 的诊断价值；采用Kaplan-Meier法及log-rank 检验生存曲线并评估患者总生存率。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ALKBH5 mRNA 和蛋白在KIRC 组织和癌旁组织中表达的比较 与癌旁组织比较，KIRC 组织中ALKBH5 mRNA 显著高表达（P＜0.01），见图1A。与癌旁组织比较，KIRC 组织中ALKBH5 蛋白也显著高表达（P＜0.01），见图1B。

图1 ALKBH5 mRNA 和蛋白在KIRC 组织和癌旁组织中表达的比较（A：基于FPKM 的ALKBH5 mRNA 表达水平比较；B：基于CPTAC z 值的ALKBH5 蛋白表达水平比较）

2.2 不同临床病理特征KIRC 患者KIRC 组织中ALKBH5 mRNA 和蛋白表达的比较 不同年龄、种族、病理分期、组织学分级的KIRC 患者KIRC 组织中ALKBH5 mRNA 表达水平比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05）。相比男性KIRC 患者，女性KIRC 患者KIRC组织中ALKBH5 mRNA 表达水平显著升高（P＜0.05）。相比B 亚型KIRC 患者，A 亚型KIRC 患者KIRC 组织中ALKBH5 mRNA 表达水平显著升高（P＜0.01）。相比SWI/SNF 染色质重塑复合物未突变组KRIC 患者，SWI/SNF 复合物突变组患者ALKBH5 蛋白表达水平显著升高（P＜0.01），见图2。

图2 不同临床病理特征KIRC 患者KIRC 组织中ALKBH5 mRNA 和蛋白表达的比较（A：年龄；B：种族；C：病理分期；D：性别；E：组织学分级；F：分子亚型；G：SWI/SNF 染色质重塑复合物突变情况）

2.3 ALKBH5 mRNA 表达水平对不同类型肾癌的诊断价值 ROC 曲线分析显示，ALKBH5 mRNA 表达水平诊断KIRC 的AUC 为0.813（95%CI：0.775～0.850），最佳截断值为5.583，灵敏度为0.667，特异度为0.900；诊断KIRP 的AUC 为0.605（95%CI：0.530～0.680），最佳截断值为6.110，灵敏度为0.218，特异度为0.950；诊断KICH的AUC 为0.707（95%CI：0.607～0.807），最佳截断值为5.086，灵敏度为0.818，特异度为0.604。ALKBH5 mRNA 表达水平对KIRC 的诊断价值最大，见图3。

图3 ALKBH5 mRNA 表达水平诊断不同类型肾癌的ROC 曲线

2.4 ALKBH5 mRNA 表达水平与KIRC 患者预后的关系 Kaplan-Meier 生存曲线表明，ALKBH5 mRNA 高表达组患者总生存率高于低表达组（P＜0.01）。亚组分析显示，男性KIRC 患者ALKBH5 mRNA 表达水平对预后无显著影响（P＞0.05）；但对女性KIRC 患者，与ALKBH5 mRNA 低表达组比较，ALKBH5 mRNA 高表达组总生存率显著升高（P＜0.05），见图4。

图4 ALKBH5 mRNA 表达水平与KIRC 患者预后的关系（A：KIRC 患者总生存率分析；B：女性亚组总生存率分析；C：男性亚组总生存率分析）

2.5 ALKBH5 在KIRC 中可能参与的信号通路GSEA 富集分析结果显示，ALKBH5 mRNA 在糖酵解通路中的标准化富集分数为2.30，FDR＜0.01，P＜0.01；在果糖和甘露糖代谢通路中的标准化富集分数为2.27，FDR＜0.01，P＜0.01；在氨基酸生物合成通路中的标准化富集分数为2.18，FDR＜0.01，P＜0.01，见图5。

图5 ALKBH5 在KIRC 中可能参与的信号通路（A：糖酵解；B：果糖和甘露糖代谢；C：氨基酸生物合成）

3 讨论

ALKBH5 基因位于染色体17p11.2，其编码蛋白含有394 个氨基酸残基，分子量约43 kD，属于非血红素铁（Ⅱ）/双加氧酶的α-烷烃羟化酶（alpha-ketoglutarate-dependent dioxygenase，ALKB）家族，是高度保守的mRNA 结合蛋白。至今为止在哺乳动物体内共发现9个ALKB 家族成员，分别为ALKBH1～8 和fat mass-and obesity-associated（FTO），其中ALKBH5 和FTO 同为m6A 去甲基化酶。不同于FTO，ALKBH5 对N6，2-O-二甲基腺苷（N6，2-O-dimethyladenosine，m6Am）无活性，可直接催化m6A 甲基化腺苷去除甲基，从而降低靶基因的m6A 水平，调控基因表达参与细胞生命活动及功能调节，且不产生中间产物。目前研究认为ALKBH5 在肿瘤细胞中既可发挥促癌作用亦可发挥抑癌作用。Chao 等[10]研究发现ALKBH5 在肺腺癌组织中高表达，通过人叉头框蛋白M1（forkhead box M1，FOXM1）mRNA 翻译效率来提高肿瘤细胞的增殖和侵袭能力。在乳腺癌中，低氧刺激可上调乳腺癌细胞内ALKBH5 mRNA 水平，介导肿瘤微环境中乳腺癌干细胞的富集[11]。相反，ALKBH5 在胰腺癌中低表达，能够提高胰腺导管腺癌细胞对吉西他滨的敏感性，抑制肿瘤细胞的增殖和迁移[12]。但目前ALKBH5 在肾癌中的研究相对较少。

本研究基于TCGA 数据库探索ALKBH5 基因在KIRC 中的表达情况，结果发现KIRC 组织中ALKBH5 mRNA 和蛋白表达水平均高于癌旁组织，与以往研究结果一致[3，13]。Guimarães-Teixeira 等[13]研究发现ALKBH5 mRNA 在KIRC 中的表达水平高于KIRP 和KICH。本研究发现，ALKBH5 诊断KIRC 的AUC 为0.813，高于KIRP（AUC=0.633）和KICH（AUC=0.707），说明ALKBH5 mRNA 表达水平可较好区分KIRC 和其他类型肾细胞癌，有望成为KIRC 诊断的生物标志物。结合KIRC 患者的临床资料进行生存分析，结果发现女性KIRC 患者肿瘤组织中ALKBH5 mRNA 和蛋白表达水平均高于男性患者，提示ALKBH5 基因和蛋白表达水平可能与性别、性激素水平等因素有关。值得注意的是，KIRC 具有显著的异质性。Brooks 等[6]基于34 个基因将KIRC 分成低风险（A 型）和高风险（B 型）两种分子亚型。本研究发现，A 型KIRC 组织ALKBH5 mRNA 表达水平显著高于B 型KIRC 组织，且生存分析发现ALKBH5 mRNA 低表达的KIRC 患者预后不良，与Brooks 等[6]的研究结果一致。SWI/SNF染色质重塑复合物被证明与KIRC 进展关系密切[14-15]。本研究中SWI/SNF 染色质重塑复合物突变组ALKBH5 蛋白表达水平高于SWI/SNF 复合物未突变组。人类SWI/SNF 染色质重塑复合体由15 个组分组成，包括1 个催化ATP 酶亚基[SWI/SNF related,matrix associated，actin dependent regulator of chromatin，subfamily A，member 4，（SMARCA4）或SMARCA2]和其他3 个 核 心 亚 基（SMARCB1、SMARCC1 和SMARCC2）[16]。双植物同源结构域（plant homeodomain，PHD）锌指家族3（double PHD fingers 3，DPF3）属于D4 蛋白家族，是SWI/SNF 复合体的非催化亚基。DPF3 表达DPF3a 和DPF3b 两种剪接变体。Cui等[17]通过体内及体外实验证实DPF3a 可促进肾癌细胞的迁移，这与临床观察到的DPF3a 在KIRC 转移患者中显著上调的结果一致[18]。在机制上，过表达DPF3a 可上调TGF-β 信号通路相关的基因表达[17]，而TGF-β 是上皮细胞-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）表型的主要诱导因子，是促进癌症转移的信号通路。有研究发现在非小细胞癌（non-small-cell lung cancer，NSCLC）中，过表达ALKBH5 可抑制TGF-β诱导的EMT，并增强NSCLC 细胞的侵袭能力[19]。然而在KIRC 细胞系769-P 中敲低ALKBH5 可下调间质化分子标志物蛋白波形蛋白（Vimentin）的表达水平[20]。推测ALKBH5 在不同组织中、在肿瘤细胞不同的恶性条件下、不同的细胞内外通路中对EMT 的调控作用是有差别的。此外，Colli 等[21]和Protze 等[18]发现位于DPF3 第1 个内含子内的风险位点（rs4903064）可产生一种缺氧反应增强子，其活性受Von Hippel-Lindau（VHL）肿瘤抑制基因调节，从而影响体外KIRC 细胞的增殖能力。在KIRC 患者的VHL 突变较为常见。DPF3 在KIRC 患者中显著上调，在存在VHL 突变的患者中尤为明显。VHL 的缺失导致缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）蛋白水平上调，进而激活参与增殖、凋亡和转移的基因的转录。值得注意的是，最新研究发现ALKBH5 启动子区存在HIF-1α 的结合位点，其核心序列为5'-RCGTG-3'，被称为缺氧反应元件chypoxia-responsive element，HRE），分别位于-486/-482（HRE A）和+265/+269（HRE B）。染色质免疫沉淀实验和荧光素酶实验均证实ALKBH5 HRE A 与HIF-1α 结合，未与HIF-2α 结合[22]。低氧条件可诱导肾癌细胞中的ALKBH5 基因表达水平上调，且该过程是HIF-1α 依赖性的。因此，本研究推测在KIRC 中SWI/SNF 复合物突变（DPF3 基因rs4903064 位点）产生缺氧反应增强子，通过HIF-1α 上调ALKBH5的表达，进而促进EMT 过程。

ALKBH5 mRNA 和蛋白高表达可能在KIRC 的演进中发挥重要作用。本研究生存分析显示，ALKBH5 mRNA 高表达的KIRC 患者总生存率高于低表达者。Guimarães-Teixeira 等[13]研究结果显示ALKBH5 mRNA表达水平与患者预后无关。Zhang 等[3]研究发现ALKBH5 高表达与KIRC 肿瘤体积较大、高恶性度、预后较差相关。上诉结果与本研究分析结果不同，可能与样本量及研究方法不同有关。本研究进一步按性别进行亚组分析，结果显示在女性KIRC 患者中，与ALKBH5 低表达组比较，ALKBH5 高表达组患者总生存率显著增高；然而，在男性KIRC 患者中，ALKBH5 mRNA表达水平对预后无显著影响。提示ALKBH5 mRNA 表达水平可成为女性KIRC 患者判断预后的有效标志物，但具体机制尚不清楚。

本研究的GSEA 富集分析结果显示ALKBH5 mRNA 可能参与糖酵解、果糖和甘露糖代谢、氨基酸生物合成等信号通路。研究发现ALKBH5 启动子区-486/-482 存在HIF-1α 的结合位点,在多种细胞系中，DNA 损伤和缺氧环境可以激活ALKBH 5 基因的转录[23]。以上结果说明ALKBH5 可能通过调控KIRC 的糖酵解过程在肾癌的发生、发展及转移等过程中发挥重要作用。

综上可知，ALKBH5 作为促瘤因子在KIRC 发生、发展、转移及预后评估过程中发挥重要作用，推测ALKNH5 有成为KIRC 诊断标志物和治疗靶点的潜在可能，同时为临床评估患者预后提供理论依据。