张德才

（海西州都兰县察苏镇畜牧兽医站，青海 都兰 816199）

随着抗菌药物及含有抗菌药物的添加剂的使用，羊胸膜肺炎放线菌对临床中常用的抗菌药物产生严重的耐药性，给羊胸膜肺炎放线菌病治疗带来一定困难，同时还威胁着人们健康。 本试验从海西州都兰县地区规模化及散养户中采集患呼吸道疾病病羊的咽拭子、鼻拭子及死亡羊的肺脏等病料样品共计198 份中分离得到70 株羊胸膜肺炎放线菌病，对分离的羊胸膜肺炎放线菌病进行耐药情况监测，为指导临床合理用药提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 病料来源

2021～2023 年采集某地区规模化及散养户中采集患呼吸道疾病病羊的咽拭子、鼻拭子及死亡羊的肺脏等病料样品198 份（见表1）。

表1 样品采集情况

1.2 主要仪器

THB 平板（含NAD） 、THB 液体培养基（含NAD），购自北京剑桥生物科技有限公司；革兰氏阴性菌生化鉴定试剂盒、临床用的8 类抗菌药物敏纸片， 均购自北京天坛药物生物技术开发公司；细菌基因组DNA 试剂盒、2×Taq Master Mix、DL2000 DNA Maker， 均购上海联迈生物工程有限公司。

1.3 细菌分离与培养

对采集海西州都兰县地区规模化及散养户中采集患呼吸道疾病病羊的咽拭子、鼻拭子及死亡羊的肺脏等病料样品198 份，对采集的病料组织样品进行编号，在无菌的条件下分别划线接种于THB 平板（含NAD）37℃培养12～18 小时后，接种于THB 液体培养基（含NAD）进行纯化培养，取纯化后分离菌株划线接种于胰蛋白胨血琼脂平板培养基上再接种金黄色葡萄球菌后，37℃培养12～24 小时后观察是否有卫星现象。

1.4 细菌生化鉴定

参照革兰氏染色试剂盒说明书， 调整菌液浓度为0.5 个麦氏浊度，对分离的细菌进行生化鉴定试验鉴定

1.5 细菌PCR 鉴定

根据胸膜肺炎放线菌的基因序列（NR_114419.1）设计通用型APP 检测引物（5’-TTATCCGAACTTTGGTTTAGCC-3’，5-CATATTTGATAAAACCATCCGTC -3’） 片段大小为418 bp，在生工生物工程(上海)股份有限公司合成通用型APP 检测引物， 提取临床分离菌株基因组DNA 为模板，用通用型APP 检测引物对分离菌株进行PCR 鉴定。

1.6 药敏试验

将临床中分离的猪胸膜肺炎放线菌用K-B药敏纸片法进行药敏试验，每1 种药物做3 个重复，取其平均值，记录每一株分离菌株的药敏试验结果。 其操作流程及判定结果参照美国临床实验室标准化协会 （CLSI）2013 年推荐的标准K-B 纸片法。 统计临床分离羊胸膜肺炎放线菌分离菌株的对临床中不同药物的耐药性。

2 结果与分析

2.1 细菌分离培养

从采集海西州都兰县地区规模化及散养户中患呼吸道疾病病羊的咽拭子、鼻拭子及死亡羊的肺脏等病料样品中分离得到的菌株，通过培养特性鉴定分离菌株在THB 平板（含NAD）长出特征性菌落形态，胰蛋白胨血琼脂平板培养基上出现典型的“卫星现象”（见图1）革兰氏染色可见分离菌株成链状排列或者单个的红色短杆菌（见图2）。 与《伯杰细菌鉴定手册》中报道的羊胸膜肺炎放线菌的培养特性、形态学及生化鉴定基本一致， 经过统计70 株分离菌株初步鉴定为羊胸膜肺炎放线菌。

图1 分离菌株的“卫星现象”

图2 分离菌株革兰氏染色结果（1000×）

2.2 细菌PCR 鉴定

从采集海西州都兰县地区规模化及散养户中患呼吸道疾病病羊的咽拭子、鼻拭子及死亡羊的肺脏等病料样品中分离的疑似70 株羊胸膜肺炎放线菌分离菌株， 通过PCR 鉴定均扩增出大约为418 bp 目的基因条带 （部分分离菌株PCR 鉴定结果见图3），70 株分离菌株从分子生物学水平上鉴定为羊胸膜肺炎放线菌。

图3 部分分离菌株PCR 鉴定结果

2.3 耐药性分析

采用K-B 药敏纸片法检测70 株羊胸膜肺炎放线菌的耐药性。 结果由表2 可知，对临床中分离的70 株羊胸膜肺炎放线菌对磺胺间甲氧嘧啶、 庆大霉素、 新霉素等10 种药物耐药率在50.0%～95.7%， 对其他的8 种药物耐药率在7.1%～31.4%。

表2 耐药性检测结果

3 讨论

近年来，在我国内蒙古、新疆、河北、山东、陕西、甘肃及河南等多个地区养殖场中关于胸膜肺炎放线杆菌引起羊死亡的报道逐渐增多，其死亡率且呈现上升的趋势，羊胸膜肺炎放线菌病是危害羊养殖中主要的细菌性呼吸道传染病之一，因此，对规模化养羊场及散养户中羊胸膜肺炎放线菌病的防控具有重要的意义。 相关研究表明，胸膜肺炎放线菌具有多种不同血清型，不同血清型的分离菌株具有不同的致病性且缺少交叉免疫反应，目前没有有效的疫苗进行预防，也是该病在不同养殖场中广泛流行的重要因素之一。本研究从采集海西州都兰县地区规模化及散养户中患呼吸道疾病病羊的咽拭子、 鼻拭子及死亡羊的肺脏等病料样品198 份分离到70 株羊胸膜肺炎放线菌， 说明羊胸膜肺炎放线菌引起海西州都兰县地区规模化养殖场及散养户中不同阶段羊的呼吸道疾病的主要病原菌之一。因此，规模化养殖场及散养户应注意羊胸膜肺炎放线菌病的综合防控。 临床防治猪胸膜肺炎放线菌病过程中不合理使用抗菌药物现象较多，导致耐药性产生， 的治疗带来一定的困难。 采用K-B 药敏纸片法检测70 株羊胸膜肺炎放线菌的耐药性。 结果显示，临床中分离的70 株羊胸膜肺炎放线菌对磺胺间甲氧嘧啶、庆大霉素、新霉素等10 种药物耐药率在50.0%～95.7%，对其他的8 种药物耐药率在7.1%～31.4%。 表明从该地区养殖场分离的羊胸膜肺炎放线菌对常用药物产生不同的耐药性。 因此，在临床治疗羊胸膜肺炎放线菌病时，应该合理使用抗菌药物，同时配合环境消毒，才能提高治疗效果。