刘 莲，柴千千，王雅婷，康靖杰，夏林波，陈晓霞

(辽宁中医药大学药学院，辽宁 大连 116600)

急性早幼粒细胞白血病(Acute promyelocytic leukemia，APL)为M3型急性粒细胞白血病(Acute myelocytic leukemia，AML)是一种造血系统的恶性克隆性疾病，其发病率为1-2/10万，M3型急性髓系白血病(Aml)的特点是骨髓中未成熟的早幼粒细胞积聚，绝大多数患者染色体易位为t(15：17)(q22：q21)[1]。中医理论认为其病因为正气不足，邪毒内蕴，耗伤营阴，耗损骨髓，髓内瘀滞，以致生血不足，气血两亏。中药复方因为其药物之间相互作用可以发挥整体调节作用被视为具有潜力的药物，复方黄黛片采用以毒攻毒的中医药思维，以雄黄为君药，青黛为臣药，太子参、丹参为佐使组成的中药复方，可通过多作用多靶点治疗白血病[2-3]，具有缓解率高，复发率低的特点[4-5]，相对三氧化二砷口服方便，利于患者回家使用，毒性低等优点，而被广泛关注。但是由于雄黄为含有砷的制剂，因此其毒性问题一直是国内外专家关心的问题。研究表明雄黄有较强的肝肾毒性、神经毒性。雄黄中砷在体内的各个部位如肝、肾、脑、心脏、肺等均有蓄积。临床服用复方黄黛片时，出现了胸闷、心悸、心电图异常等现象[6]，这些现象随着停药可得到缓解，说明复方黄黛片有轻度心脏毒性。因此对复方黄黛片及雄黄心脏毒性研究可为复方黄黛片的临床应用及其对心脏影响具有指导意义。本实验经过文献调研，对该组方进行深入细仔的研究，认为雄黄可能是引起其心脏不适的主要物质。雄黄引起心脏毒性的主要物质为水溶性砷盐。因此本实验以大鼠为模型，研究复方黄黛片、雄黄及雄黄水飞上层液给药后在大鼠心脏中总砷累计量，探讨复方黄黛片引起心脏毒性可能的物质基础。

1 实 验

1.1 仪器与材料

ICP-AES电感耦合等离子体发射光谱仪，美国安捷伦科技有限公司；AUW 220D万分之一电子天平，日本岛津有限公司；电子控温加热板，上海新仪微波化学科技有限公司；Mini spin常温超速离心机，德国Eppendorf公司。

雄黄、复方黄黛片，安徽天康药业有限公司；砷标液 1 000 mg/L，上海试剂有限公司；其他试剂均为分析纯；水为超纯水。

清洁级健康成年SD大鼠70只，体重(200±20)g，雌雄各半，购自辽宁长生生物有限公司，许可证号：scxk(辽)2015-0001；饲料及垫料购自辽宁长生生物有限公司，严格按照中华人民共和国《实验动物小鼠大鼠配合饲料》(GB14924.3-2001)进行配制生产。

1.2 实验方法

1.2.1 实验动物分组及处理

大鼠在清洁级环境饲养，温度保持在(22±3)℃，湿度50%，明暗交替12 h，适应性喂养3天。将70只大鼠按照40 mg·kg-1剂量腹腔注射戊巴比妥钠溶液麻醉后仰位固定，将针形电极插入四肢皮下，连接心电图机，记录标准Ⅱ导联心电图。取心电图正常者随机分为7组 (每组10只，雌雄各半)，分别为生理盐水对照组、雄黄高、低剂量组；复方黄黛片高、低剂量组及水溶性砷高、低剂量组。复方黄黛片临床指导剂量每日最多30片，本实验为了进一步研究其毒性，将药物给药量折算为日用量的1.5倍，折算后配置成雄黄高剂量浓度18 mg·mL-1，低剂量组浓度为9 mg·mL-1，复方黄黛片高剂量浓度为108 mg·mL-1，低剂量组为54 mg·mL-1，上述溶液均以0.5%CMC-Na配置成混悬液；水溶性砷溶液，则与雄黄高、低剂量组用相同量的雄黄，加入与CMC-Na相同体积的水，不停的研磨雄黄2 h，静止，取上清液。上述溶液均经口服灌胃给予大鼠，每天一次，每周给药六天，连续给药八周，末次给药后腹腔注射戊巴比妥钠，麻醉后取其心脏，置于-20 ℃冰箱保存备用。

1.2.2 砷标液制备

准确移取砷标液1 mL于100 mL容量瓶中，以1%HNO3定容至100 mL，作为储备液，分别取0、0.5、1、2、3、4、5 mL的10 mg/L标液，以1% HNO3定容至100 mL，制备砷标液。

1.2.3 样品溶液液制备

精密称取心脏1 g，加入硝酸2 mL，匀浆后，至于电热板上加热温度至180 ℃，至变成完全透明液体后，继续加热至不冒白烟，以5% HNO3定容至10 mL，制备待测液。

1.2.4 测定条件

仪器点火稳定后，进行矩管准直和波长校正，编辑方法，调节合适的等离子条件，优化最佳仪器参数，功率：1.2；等离子气体流量：15 L/min；辅助气体流量1.5 L/min；雾化器压力200 kPa。

1.3 统计方法

所有数据均采用SPSS13.0software(SPSS，USA)进行分析。所有数据行正态分布检验，证实其为正态分布样本，表达值以均值±标准差表示。P值<0.05具有统计学意义

2 结果与分析

2.1 线性关系

将配置好的系列对照品溶液，按“2.1”下的条件进行测定，记录峰面积(y)为纵坐标，浓度(x)为横坐标，进行线性回归，结果见图1。砷浓度在0～0.5 mg·L-1范围内成线性关系，其线性方程为Y=8 844X+5.8，相关系数R=0.999 9。

图1 砷标准曲线

2.2 方法学考察

2.2.1 精密度测验

精密度实验可以通过RSD值的大小，确定实验方法中的偶然误差的大。生物样品测定中，以ICP-AES测定样品，其方法精密度实验RSD一般不超过3%。本实验以高剂量雄黄给药后心脏样品连续测定5次，以总砷含量计算精密度其RSD为2.3%，小于3%，表明该方法精密度良好，适用于样品含量测定。

2.2.2 稳定性试验

取同一高剂量雄黄给药后心脏供试品溶液，分别在制备0、2、4、6、8、12、24 h进样测定，结果RSD值为1.99%，小于3%，表明样品溶液在24 h内稳定性良好。

2.2.3 重复性试验

取同一高剂量雄黄给药后心脏供试品溶液6份，按照供试品方法制备样品进行含量测定，结果RSD值为2.2%，小于3%，表明方法重复性良好。

2.2.4 加样回收率试验

准确称取雄黄高剂量组大鼠心脏约0.5 g 5份，准确加入10 mg·L-1砷标液300 μL，按照测定条件进行测定，实验结果见表1，计算平均回收率为78%。符合生物样品测定回收率在50%～80%之间要求，说明方法准确度良好。

表1 精密度实验

表2 稳定性实验

表3 重复性实验

表4 回收率测定

2.2.5 检测限

根据S/N=3计算得到实验的检测限为15 μg·L-1。

2.2.6 大鼠心脏总砷含量测定

按照实验方法对不同给药组大鼠心脏中总砷含量进行测定，结果如图2所示。每组大鼠心脏10只，各剂量雄黄给药组与同剂量复方黄黛片给药组及雄黄水给药组间无显著性差异。

图2 不同给药组大鼠心脏组织中总砷含量测定

3 结 论

本文以大鼠为研究对象，分别口服给予临床剂量1.5倍量折算后药量，连续8周，模拟临床长期服用复方黄黛片，测定其心脏中总砷含量。发现低剂量复方黄黛片组心脏中总砷的含量与低剂量雄黄组总砷含量相当，高剂量复方黄黛片组较雄黄高剂量组有所增加，高、低剂量雄黄水溶液组大鼠心脏总砷含量较雄黄组含量有下降趋势，但无显著性差异。因此说明大鼠心脏毒性是因为水溶性砷可分布在心脏组织中而引起的。

复方黄黛片是由原解放军第210医院黄世林教授于上世纪创制的中药复方制剂，其君药为雄黄，遵循中医“以毒解毒”思想，起到主要缓解作用；臣药为青黛，具有除热解毒凉血之功效，起到协同作用，增强解毒清热功效；丹参和太子参为佐使药可起到活血祛癖、益气生血的同为。该方中四味中药体现了中药配伍相的相得益彰的博大精深，具有驱邪扶正、解毒清热和活血生血之功效。临床上对急性早幼粒细胞白血病有特异疗效，完全缓解率达100%，而复方黄黛片联合进行序贯化疗治疗，3年生存率为 88.52%，复发率12.9%，5、7、10年生存率均为86.88%[5]。采用现代医学手段研究发现砷剂可引起癌蛋白的降解，靛玉红能够抑制细胞周期、增加负责运输硫化砷的蛋白的基因表达，丹参酮可促进细胞分化且促进负责运输硫化砷的蛋白的基因表达，太子参增强机体免疫力，常用于肿瘤经手术、放疗、化疗后白细胞减少、血小板降低之患者。进一步采用分子生物学技术对复方黄黛片治疗白血病机制研究，阐明了复方黄黛片的多成分通过多靶点作用治疗白血病，为中药方剂君、臣、佐、使配伍原则的科学性提供依据。复方黄黛片已成为雄黄配伍其他中药或雄黄联合西药如抗癌的成功范例。

雄黄为硫化物类雄黄族的矿石，最早记载于《神农本草经》，是常用中药，也是中国药典记载的的28种毒性药材之一，其主要成分为四硫化四砷(As4S4)[7]，具有祛风除湿、解毒杀虫功效。现代药理研究表明其具有抗菌、抗病毒和抗肿瘤等作用，临床上广泛用于治疗慢性粒细胞白血病、带状疱疹和淋巴结核等多种疾病[8]。雄黄在我国中药历史中使用率极高，2020年版中国药典含雄黄的复方制剂就有26个，这些复方因在治疗某些中医病症方面具有独特的效果，历史沿用至今。但是砷作为一种毒性元素，其安全性始终是我们关心的主要问题，因此雄黄及其复方的安全性问题也倍受关注，其应用在国外也遭到了限制甚至禁止[9]。因此，为了安全、合理使用雄黄及其复方制剂，尽可能减少毒性反应的发生，人们对雄黄及其复方开展了较多的毒理学研究。本文通过对复方黄黛片与雄黄及雄黄水溶性物质对大鼠心脏中砷的积累的测定比较分析，发现复方黄黛片的心脏毒性主要是由水溶性砷引起的。雄黄作为矿物性药物，其在临床使用时，需经过水飞加工除去其中的水溶性砷，但往往由于产地及炮制工艺不同，而导致其水溶性砷含量不同，由此制备的复方黄黛片引起的心脏毒性大小可能也会不同，值得引起临床重视。