刘娇娇，况亚伟

(常熟理工学院电子信息工程学院，江苏 常熟 215500)

有机化学是化学、化工、药学专业的专业基础课，也是材料化学、物理学、生物化学、药物化学等众多专业的基础课程[1-2]。基于此，学好有机化学基本理论知识，对于拓展知识范围、增强创新能力和促进学生高素质全面发展起到了积极的作用。有机化学实验是四大基础化学实验之一，化学、物理化学、高分子材料、生物化学、环境保护、农业等专业都会用到有机化学实验。因此掌握有机化学实验是非常重要的。但是，在有机化学实验教学中，大多数老师采用传统的教学模式，以教师讲授实验基本原理、实验操作方法为主[3]。这会导致学生学习兴致缺乏、学习效果不佳。因此在有机化学实验教学中引入前沿科研成果是十分有必要的。前沿科技成果引入实验教学可以解决传统实验教学模式带来的内容枯燥、缺乏创新、效果不佳等问题，还可以培养学生的创新意识，在潜移默化中引导学生找到未来的学习研究方向[4]。然而如果不掌握正确的方式，一味的机械式向学生传输前沿科研成果的理论内容，往往得不到理想的效果，学生可能会因为内容太深奥枯燥无味而很快失去学习的兴趣和积极性。近年来很多高校的教育者想到了将前沿科技成果的实验内容与实验教学中的理论部分相结合的方法来提高学生学习兴趣，以达到更好的学习效果[5-6]。

抗菌肽(AMPs)多数是由氨基酸残基构成，具有广谱抗菌活性，是高等生物免疫系统中必不可少的一环，主要存在于植物、昆虫及人类细胞中，可作为免疫反应或直接抗感染剂的先天调节剂[7]。抗菌肽多为具有良好抗菌活性的天然多肽，因其独特的抗菌机制，可有效地杀灭一些耐药性病原体而备受关注。因此，抗菌肽是一种极具潜力的新型抗菌试剂。蜂毒肽(melittin)是抗菌肽的一种，是一种由26个氨基酸组成的阳离子肽[8]，其有效的抗菌活性甚至能杀伤肿瘤细胞、破坏HPV[9]。

石墨烯家族材料(例如GO)是一种新的生物相容性材料，它高的比表面积允许表面高密度的功能化修饰，可以作为药物载体。因为石墨烯材料的二维结构，单片的石墨烯两侧都可以修饰其他物质，也可以进行表面功能化或者吸附在另外的基底上，石墨烯表面可以通过共价键或者非共价键作用来连接其他物质，这样能提高氧化石墨烯的生物相容性及稳定性。

本次实验用到的是氧化石墨烯的量子点，尺寸约为39 nm，表面作了羧基改性，能够与蜂毒肽末端氨基发生脱水缩合反应。得到GOQDs@melittin复合物，做了复合材料的表征测试，验证了GOQDs@melittin复合物的形成。最后，将制备的GOQDs@melittin复合物用来做抗菌测试，发现GOQDs@melittin复合物比melittin的抗菌效率高。

在我们学校的有机化学实验课堂中，用乙酰苯胺的制备实验让学生掌握酰胺化的原理及重结晶操作。但是这个实验的完成采用了老师讲授实验要点、注意事项，演示实验过程，学生重复操作，然后撰写实验报告的模式，整个过程枯燥无味，学生的学习效果很难保证，学习兴致也不高。基于这种现状，我们针对酰胺反应，设计了创新实验课程，用抗菌肽melittin的末端氨基与羧基改性的氧化石墨烯量子点发生缩合反应，反应完成后用透析的方法进行提纯，然后表征了复合物的形成，最后将制备得到的复合物用于抗菌测试，结果表明得到的复合材料抗菌效率更高。氧化石墨烯，抗菌肽都是较为前沿用于科研的材料，作者对两种材料都有较为深入的研究，且在新型抗菌药物的设计方面有很多研究成果，通过将科研成果融入有机化学创新实验中，可以让学生在掌握氨基羧基脱水缩合反应理论、相关实验操作的同时，还能够学习材料的表征知识，最后复合材料用于抗菌，这涉及到生物化学的内容，让学生对学科交叉融合有了基本了解，通过这样的设计能够激发学生的学习兴趣、培养了他们的科学思维，提升了他们的科学素养。

1 实验目的

(1)熟悉溶液中氨基、羧基脱水缩合反应的方法。

(2)了解化合物常见的表征方法，了解相关表征仪器所需样品的制备过程、原理。

(3)学习缩合反应的常规操作。

(4)了解所制备的复合抗菌材料的实际应用。

2 实验原理

羧基改性的氧化石墨烯量子点(GOQDs)，与蜂毒肽表面的氨基通过脱水缩合反应得到GOQDs@melittin复合物。

3 仪器、试剂及表征手段

3.1 仪器与试剂

蜂毒肽(melittin)，膦酰基乙酸三乙酯缓冲液(TEPA)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，恒温摇床，羧基改性的氧化石墨烯量子点(GOQD)，烧杯，玻璃瓶，磁力搅拌器，透析袋(MW3500)，Malvern Zetasizer Nano ZS90动态光散射，UK；Asylum Research MFP-3D-SA原子力显微镜；Hitachi HT7700透射电子显微镜，日本产；Raith Pioneer扫描电子显微镜，德国产；Thermo，Nicolet 6700傅里叶红外光谱仪；LSM-710激光扫描共聚焦显微镜，Carl Zeiss；酶标仪，CO2培养箱，细菌培养液，96孔板，移液枪。

3.2 表征方法

3.2.1 动态光散射(DLS)

本次实验中用到GOQDs、GOQDs@melittin的尺寸用动态光散射(DLS)来测量，用到的仪器型号为Malvern Zetasizer Nano ZS90，UK。

3.2.2 原子力显微镜(AFM)

用型号为Asylum Research MFP-3D-SA的原子力显微镜(AFM，液相轻敲模式扫描)测量GOQDs、GOQDs@melittin的尺寸及厚度、表面形貌。AFM的关键技术是将微小探针安装在微悬臂一端，通过探针与样品表面发生接触，激光打在探针上，探针在样品表面运动，激光的反射光束随之偏转以此记录下样品的表面轮廓。

3.2.3 透射电子显微镜(TEM)

用TEM对GOQDs、GOQDs@melittin材料的微观成像性能进行研究。实验中用到的TEM的型号为 Hitachi HT7700，日本产。其基本原理是用非常细的高能入射电子作为光源轰击样品表面，在样品表面产生二次电子，从而获得样品放大的显微形态。

3.2.4 傅里叶红外光谱

傅里叶变换红外光谱仪基于物质对红外光谱的吸收，用来表征材料的分子结构和化学键等信息。GOQDs@melittin复合材料的表征中就用到了型号为(Thermo，Nicolet 6700)傅里叶红外光谱仪。

3.2.5 酶标仪

酶标仪本质上是一台分光光度计，通过测量细菌+药物溶液吸光度，将得到的信号进行处理计算，获得最终的吸光度数值，通过计算可以得出细菌的存活率，得到药物对细菌的最小抑菌浓度。

3.2.6 激光扫描共聚焦显微镜(CLSM)

CLSM的原理是激光作为光源，用激光点扫描样品，通过光源和探测器前的针孔，如若两个针孔尺寸一致，则与焦平面上光点形成共轭，即所谓的共聚焦，这样就只能探测到焦平面上的光点，焦平面外的光点则不能成像，提高了显微镜的分辨率。

4 实验步骤

4.1 氨基羧基脱水缩合反应-酰胺反应

抗菌肽melittin 1 mg，加入5 mM的TEPA缓冲溶液1 mL；然后加入50 mM EDC 1 μL，100 mM NHS 1 μL，其中EDC，NHS需要现配现用。室温20 ℃以内，250 rpm摇晃10 h。melittin与GOQDs以8∶1的比例加入量子点，室温20 ℃以内，250 rpm摇晃2 h，获得的复合物透析(MW 3500)以除去过量的蜂毒肽，并浓缩到所需要浓度进一步实验。

4.2 GOQDs@melittin复合物的的应用-抗菌测试

在96孔板中加入100 L肉汤，然后将GOQDs、GOQDs@melittin梯度混合至8、16、32、64、128 μg·mL-1。将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌配到最终浓度为105CFU/mL，并向每个孔中添加100 μL，使原药物浓度减半(从128 g·mL-1到4 g·mL-1)。多粘菌素作为大肠杆菌的对照药物，夫西地酸作为金球菌的对照药物。使用封口膜将孔板密封住，在37 ℃的细菌培养箱中培养12～16 h。用酶标仪读取各孔的吸光度值，通过计算得到MIC值，MIC值记录了杀死90%细菌的最低浓度。所有MIC测量值均为三次以上独立实验的平均值。

5 实验结果分析

5.1 GOQDs@melittin复合材料的表征

从图1中可以看到，GOQDs的尺寸为(39±10)nm。经过蜂毒素修饰后，GOQDs颗粒的尺寸增大了大约为125 nm，大于纯GOQDs的尺寸。这可能是因为GOQDs与melittin发生了反应，形成了复合物导致尺寸增大。

图1 GOQDs，GOQDs@melittin的DLS表征图

通过X透射衍射检测了本文所用到的石墨烯量子点，发现其是层状结构，通过计算得到层间距为8.5 Å。根据在液体中测量的AFM图像(图2所示)，得到GOQDs的厚度约为3.2 nm，通过计算为4～5层。melittin与GOQDs连接后，材料的高度值发生强烈偏差，这可能是由于石墨烯表面修饰上了蜂毒肽。

图2 GOQDs、GOQDs@melittin的原子力显微镜表征图

从图3中可以看出，GOQDs@melittin的尺寸比GOQDs大，GOQDs@melittin表面更平滑，GOQDs表面不规则，局部会有突出的尖端。这可能是由于GOQDs表面修饰了melittin导致的。

图3 GOQDs、GOQDs@melittin的TEM图像

从图4中可以看出，GOQDs@melittin，melittin两种材料在3423 cm-1处有较强的吸收，这是氨基上的-NH伸缩振动的结果[10]，在1655 cm-1左右强的吸收峰是酰胺键的特征吸收峰，melittin中酰胺键特征吸收峰在1655 cm-1，而GOQDs@melittin的酰胺键的特征吸收峰为1641 cm-1，与纯melittin有所偏移，这可能是GOQDs的羧基与氨基脱水缩合形成的酰胺键与氨基酸的酰胺键之间存在一些差别。

图4 GOQDs@melittin、melittin的红外光谱图

5.2 GOQDs@melittin复合材料的应用-抗菌测试及表征

为了测试GOQDs@melittin的抗菌效果，我们分别测量了GOQDs@melittin对革兰氏阴性菌大肠杆菌(E. coli)和革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(S. aureus)的最低抑菌浓度MIC。蜂毒肽、GOQDs、多粘菌素(一种抗生素，作用于大肠杆菌)和夫西地酸(一种抗生素，作用于金黄色葡萄球菌)的抑菌情况作为对照，如图5A所示。GOQDs@melittin的MIC值分别为1.2 μg/mL(大肠杆菌)和5.0 μg/mL(金黄色葡萄球菌)；而蜂毒肽的MIC值分别为 25.0 μg/mL和45.0 μg/mL，对比于蜂毒肽，GOQDs@melittin的抗菌能力得到了大幅度提高。用扫描电子显微镜(SEM)观察了GOQDs@melittin与细菌作用前后的形态变化，发现加入GOQDs@melittin后细菌膜表面会出现明显的损伤和坍塌现象(如图5 B所示，黄色箭头所指处所示)。这说明GOQDs@melittin对细胞膜具有很强的破坏性。这些结果都表明GOQDs@melittin复合材料较melittin有更高的抗菌效率。间接证明GOQDs与melittin形成了复合材料。

图5 GOQDs@melittin复合物作用于大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的MIC测试(A)及GOQDs@melittin复合物与大肠杆菌、金黄色葡萄球菌作用前后的SEM图(B)

5.3 纳米杂化材料与细胞膜作用方式的测量(抗菌的机制)

GOQDs@melittin复合结构能够插入细胞膜是它具有高效抗菌能力的基础。为了验证这一点，用单层巨囊泡GUV作为细胞膜模型。将不同浓度的纯melittin，GOQDs@melittin加入到包裹有钙黄绿素的GUV溶液中(如图6(A)～图6(C)所示)，然后通过共聚焦显微镜观察发现，低浓度的GOQDs@melittin加入囊泡中会立刻发生钙黄绿素泄漏，但GUV形貌保持完整。说明加入melittin后会在单层巨囊泡的磷脂膜上形成孔，造成了钙黄绿素的泄露。而对于纯melittin而言，加入melittin(0.35×10-6M)至少二十分钟才能观测到钙黄绿素泄露现象。这表明GOQDs@melittin，melittin两种材料在临界成孔浓度上存在很大差异，且GOQDs@melittin的临界成孔浓度明显更小，表明GOQDs@melittin复合物成孔能力更强。另外，GOQDs @ melittin与囊泡相互作用过程中GOQDs@melittin与膜存在共定位现象(图6(C))，表明GOQDs@melittin确实可能是通过插入的方式进入细胞膜中。

6 结 论

本实验通过简单的脱水缩合反应制备了GOQDs@melittin复合材料。得到以下结论：

(1)DLS、AFM、TEM、红外光谱证明了GOQDs@melittin复合材料的成功制备。

(2)抗菌测试结果显示GOQDs@melittin作用于大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC值分别为1.2 μg/mL和5.0 μg/mL；而蜂毒肽作用于这两种细菌的MIC值分别为25.0 μg/mL和45.0 μg/mL，这表明GOQDs@melittin复合材料的抗菌效率较melittin高，这也间接证明了GOQDs与melittin形成了复合物。

7 教学建议

本实验可以面向化工、化学、材料、生物化学、药物化学等专业的本科生开展，可以与化学理论课程同步进行也可以作为创新性实验开展。科研成果融入有机化学实验课堂，可以帮助学生更好的消化理论知识，还能够提高学生的科研兴趣。

该创新型实验课程建议安排5～6课时，实验教学过程包括前期的查阅文献撰写预习报告，实验中的常规操作，基本问题的分析，表征测试结果的分析及实验报告的撰写，最后引导学生通过知网、万方、维普等数据库查阅一些文献资料，结合实验结果撰写科技论文。科技论文中需要介绍氧化石墨烯、抗菌肽材料的研究现状，抗菌肽抗菌效率提高的方法，抗菌肽表面修饰后材料的表征方法等内容。在实验过程中作为老师，要引导学生主动思考、分析问题，达到理解所学知识的目的。例如，在氨基与羧基的缩合反应中，为什么melittin与GOQDs的比例为8∶1，为什么该反应要在室温下进行。同时也要演示表征仪器的使用、讲解原理及注意事项，对于表征的结果也要引导学生学会自己分析。

最后需要评价体系，对学生的整个实验过程有正确完整的评价。实验完成后学生需按照具体要求提供预习实验报告、实验报告、科技论文。整个有机化学创新实验课程的总成绩应为预习实验报告占比20%，实验操作占比30%，实验报告占比20%，科技论文占比30%。通过这样的设置，既考查了学生的自学、查阅文献的能力，也考量了学生的动手操作能力及分析解决问题的能力。且引导学生查阅资料，撰写论文还能够激发学生的科研热情。

将科研成果引入有机化学创新性实验中，在加深学生对相关理论知识理解的同时，还能优化、丰富实验教学的内容。将科研成果与实验课程相结合，能够提高学生对专业课程的学习兴趣。本次实验内容丰富，涉及到多门学科的交叉融合，能够充分锻炼学生的动手能力及创新思维。此外，整个表征过程可以培养学生操作仪器设备的能力，抗菌测试能够引导学生将专业知识用到科研实验中，开拓学生的创新思维。