周佳琪,郭盛,李洁,康宏杰,郭兰萍,段金廒

(1.南京中医药大学中药资源产业化与方剂创新药物国家地方联合工程研究中心/江苏省中药资源产业化过程协同创新中心/国家中医药管理局中药资源循环利用重点研究室,江苏 南京 210023;2.宁夏枸杞创新中心,宁夏 银川 750002;3.中国中医科学院中药资源中心,北京 100700)

宁夏枸杞LyciumbarbarumL.为茄科多年生落叶灌木植物,在我国应用历史悠久,自古便作为药食两用品种[1]。经过长期自然选择、人工驯化及定向培育,宁夏枸杞已经形成了多个栽培品种并在宁夏、青海、内蒙古、甘肃、新疆等地广泛种植[2]。宁夏枸杞的成熟果实及根皮均被2020年版《中华人民共和国药典》[3]收录,作为枸杞子和地骨皮广泛用于临床。枸杞的叶片在众多本草典籍均有记载,俗称天精草[4],最早于《毛诗草木鸟兽虫鱼疏》[5]中记载:“茎、叶及子,服之轻身益气尔”,之后在《本草经集注》[6]、《食疗本草》[7]、《日华子本草》[8]、《本草纲目》[9]等典籍中均记载其具有止消渴,解热毒,明目等功效。现代《中药大辞典》中记载枸杞叶“补虚益精,清热明目。主治虚劳发热,烦渴,目赤昏痛,障翳夜盲,崩漏带下,热毒疮肿”[10]。目前,宁夏枸杞叶以枸杞茶之名收录于《宁夏中药材标准》[11]中,具有滋补肝肾、养血益精、明目润肺之功。

宁夏枸杞叶除作为药用外,也多作为地方习用茶饮及鲜蔬食用。以宁夏枸杞叶为原料制成的茶饮已在宁夏、青海等省区形成食品安全地方标准[12-13]。其中,在宁夏食品安全地方标准(DBS 64/684-2022)[12]中将枸杞叶茶分为2类:以枸杞树新梢的嫩叶加工的茶为枸杞叶茶和以枸杞树新梢的芽加工的茶为枸杞芽茶;而在青海食品安全地方标准(DBS 63/0004-2021)[13]中规定枸杞芽茶以枸杞树的芽或嫩叶为原料。有研究表明宁夏枸杞叶中含有丰富的黄酮类、酚酸类和生物碱类成分,并具有较好的抗炎、抗氧化、降血糖、调血脂等药理活性[14-16]。目前对于不同品种及不同成熟度宁夏枸杞叶中有效成分变化规律及其抗氧化活性的研究尚不充分。此外,随着宁夏枸杞产业的快速发展,已有研究选育了以采摘叶片为主要利用目的,少果或无果的叶用宁夏枸杞新品种,并形成了产业化示范。据此,本研究分别收集了目前栽培面积较大的果用枸杞主栽品种宁杞7号和叶用枸杞主栽品种宁杞菜1号不同成熟度的叶片,通过超高效液相串联质谱(UPLC-TQ-MS)对其中主要的黄酮类、酚酸类和生物碱类成分进行定量分析,并以1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2'-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)自由基清除能力和铁离子还原力作为指标对其抗氧化活性进行评价,以期为我国宁夏枸杞叶资源利用提供依据。

1 材料

1.1 仪器

Vanquish UHPLC系统(美国Thermo公司);Thermo ScientificTMTSQ QuantisTM三重四极杆质谱仪(美国Thermo公司);BT125D电子分析天平(德国Sartorius公司);KQ-250E型超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司);GL-16GII型离心机(上海安亭科学仪器厂);Enspire多功能酶标仪(美国PerkinElmer公司)。

1.2 试剂

对照品:苹果酸(批号:CFS202101)、琥珀酸(批号:CFS202101)、新绿原酸(批号:CFS202201)、原儿茶醛(批号:CFS202101)、绿原酸(批号:CFS202202)、槲皮素-3-O-芸香糖-7-O-葡萄糖苷(批号:CFS202102)、隐绿原酸(批号:CFS202201)、5-O-阿魏酰奎宁酸(批号:CFS202103)、芦丁(批号:CFS202202)、对香豆酸(批号:DST210508-057)、东莨菪素(批号:CFS202102)、山柰酚-3-O-芸香糖苷(批号:CFS202103)、异绿原酸B(批号:CFN202201)、异绿原酸A(批号:CFS202202)、槲皮素(批号:JZ21070912)、芹菜素(批号:T04S8F43072)均购自南京良纬生物科技有限公司;咖啡酸(批号:110885-201703)购自中国食品药品检定研究院;甜菜碱(批号:CFS202101)购自南京良纬生物科技有限公司;葫芦巴碱(批号:N22HB202063)购自上海源叶生物科技有限公司。质量分数均大于98%。

乙腈及甲酸均为质谱纯(德国Merck生物科技有限公司);实验用水为屈臣氏饮用水;其余试剂均为分析纯。

DPPH、ABTS检测试剂盒购自南京建成生物工程研究院(批号:20230616、20230710)。Ferric-tri-pyridyl-tria-zine(Fe3+-TPTZ)检测试剂盒(批号:063022230505)购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.3 药材

新鲜宁夏枸杞叶样品于2022年7月22日采自宁夏百瑞源枸杞种植基地(经度:106°9′40′′,纬度:38°38′27′′),不同成熟度宁夏枸杞叶采自同一枝条,叶芽取植株主茎尚未展开的芽,幼叶取植株枝条上部刚展开的叶,嫩叶取枝条中部生长茂盛的叶片,成熟叶为枝条最下部已成熟的叶,样品信息及形态见表1和图1。所有样品经南京中医药大学段金廒教授鉴定为茄科植物宁夏枸杞LyciumbarbarumL.的叶或芽。样品收集后统一于热风烘箱中60 ℃烘干,粉碎后过40目筛,存于干燥箱备用。

注:G1.宁杞7号叶芽;G2.宁杞7号幼叶;G3.宁杞7号嫩叶;G4.宁杞7号成熟叶;C1.宁杞菜1号叶芽;C2.宁杞菜1号幼叶;C3.宁杞菜1号嫩叶;C4.宁杞菜1号成熟叶

表1 不同品系不同成熟度宁夏枸杞叶样品信息

2 方法与结果

2.1 黄酮类和酚酸类等成分测定方法的建立

2.1.1 供试品溶液的制备 精密称取宁夏枸杞叶样品粉末0.5 g,精密称定,置于50 mL具塞锥形瓶中,精密加入25 mL 70%甲醇水溶液,超声提取40 min,补足减失质量,摇匀,16 060×g低温离心10 min,取上清液,经0.22 μm微孔有机滤膜滤过,取续滤液即得供试品溶液。

2.1.2 对照品溶液的制备 精密称取对照品适量,加入70%甲醇制成质量浓度分别为苹果酸1.38 mg·mL-1,琥珀酸1.15 mg·mL-1,新绿原酸1.53 mg·mL-1,原儿茶醛0.990 mg·mL-1,绿原酸1.05 mg·mL-1,槲皮素-3-O-芸香糖-7-O-葡萄糖苷1.60 mg·mL-1,隐绿原酸0.930 mg·mL-1,咖啡酸1.63 mg·mL-1,5-O-阿魏酰奎宁酸1.02 mg·mL-1,芦丁1.07 mg·mL-1,对香豆酸1.26 mg·mL-1,东莨菪素1.03 mg·mL-1,山柰酚-3-O-芸香糖苷1.30 mg·mL-1,异绿原酸B 1.00 mg·mL-1,异绿原酸A 1.81 mg·mL-1,槲皮素1.60 mg·mL-1,芹菜素0.216 mg·mL-1的对照品储备液。取不同体积上述储备液稀释后制成系列浓度的混合对照品溶液以进行线性关系考察。

2.1.3 色谱条件 色谱柱:ACQUITYTMUPLC BEH C18色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm);流动相:A为0.1%甲酸水溶液,B为乙腈溶液;梯度洗脱:0～1 min,95%A;1～3 min,95%→78%A;3～7 min,78%→55%A;7～9 min,55%→5%A;9～10 min,5%→95%A;10～11 min,95%A;流速:0.3 mL·min-1,柱温:35 ℃,进样量:2 μL。

2.1.4 质谱条件 采用电喷雾离子源(ESI)负离子扫描模式,检测方式为多反应检测(MRM);毛细管电压:2.5 kV;传输毛细管温度:350 ℃;雾化温度:350 ℃;鞘气流量:50 psi;辅助气流量:10 psi;CID气压:0.199 5 Pa,Q1和Q3的分辨率均为1.162 4×10-27。各成分具体质谱检测条件见表2。17个成分的MRM色谱图见图2。

注:1.苹果酸;2.琥珀酸;3.新绿原酸;4.原儿茶醛;5.绿原酸;6.槲皮素-3-O-芸香糖-7-O-葡萄糖苷;7.隐绿原酸;8.咖啡酸;9.5-O-阿魏酰奎宁酸;10.芦丁;11.对香豆酸;12.东莨菪素;13.山柰酚-3-O-芸香糖苷;14.异绿原酸B;15.异绿原酸A;16.槲皮素;17.芹菜素

表2 各成分的质谱检测参数

2.1.5 线性关系、检测限及定量限考察 分别精密吸取“2.1.2”项下制备的系列混合对照品溶液,按照“2.1.3”和“2.1.4”项下条件进样测定,以对照品溶液浓度(μg·mL-1)为横坐标,峰面积为纵坐标绘制标准曲线,计算线性回归方程和相关系数r,并在S/N为3和10时记录检测限(LOD)和定量限(LOQ)。结果详见表3,所有标准曲线在线性范围内均呈良好的线性关系。

表3 黄酮类和酚酸类等成分线性关系及LOD和LOQ分析结果

2.1.6 精密度、重复性及稳定性考察 取混合对照品溶液,按“2.1.3”和“2.1.4”项下条件连续进样6次,计算各成分峰面积的RSD值,见表4。所有成分RSD值范围在0.32%～4.99%,表明仪器精密度良好;取宁杞菜1号嫩叶(G3)样品6份,每份0.5 g,平行制备供试品溶液,分别按“2.1.3”和“2.1.4”项下条件进样分析,计算各成分含量的RSD值,所有成分RSD值范围在0.82%～4.96%,表明该方法重复性良好;取G3样品,分别于0、2、4、8、12、24 h进样测定,以各成分峰面积的RSD值考察其稳定性,所有成分RSD值范围在0.49%～4.86%,表明该方法样品稳定性良好。

表4 黄酮类和酚酸类成分精密度、重复性、稳定性及加样回收率考察结果(%,n=6)

2.1.7 加样回收率实验 取宁杞菜1号幼叶(G2)样品6份,精密称定,分别加入与样品中各成分含量等量的16种对照品,按“2.1.3”和“2.1.4”项下条件进样分析,计算回收率和RSD值,结果见表4,所有成分回收率范围在98.08%～102.86%,RSD值范围在1.25%～3.55%,表明该方法回收率良好。

2.2 生物碱类成分测定方法的建立

2.2.1 供试品溶液的制备 精密称取宁夏枸杞叶样品粉末0.5 g,精密称定,置于50 mL具塞锥形瓶中,精密加入20 mL 超纯水,超声提取40 min,补足减失质量,摇匀,16 060×g低温离心10 min,取上清液,经0.22 μm的微孔滤膜滤过后取续滤液即得供试品溶液。

2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取对照品适量,加入超纯水制成质量浓度分别为甜菜碱1.00 mg·mL-1和葫芦巴碱1.15 mg·mL-1的对照品储备液。取不同体积上述储备液稀释后制成系列浓度的混合对照品溶液以进行线性关系考察。

2.2.3 色谱条件 色谱柱:ACQUITY UPLC BHE Amide色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm);流动相:A为0.1%甲酸水溶液,B为乙腈,梯度洗脱:0～1 min,10%A;1～3 min,10%→18%A;3～6 min,18%→20%A;6～7.5 min,20%→37.5%A;7.5～9 min,37.5%→10%A;9～10 min,10%A。流速:0.25 mL·min-1,柱温:30 ℃,进样量:2 μL。

2.2.4 质谱条件 采用电喷雾离子源(ESI)正离子扫描模式,检测方式为多反应检测(MRM);毛细管电压:2.5 kV;传输毛细管温度:350 ℃;雾化温度:350 ℃;鞘气流量:50 psi;辅助气流量:10 psi;CID气压:0.199 5 Pa,Q1和Q3的分辨率均为1.162 4×10-27。各成分具体质谱检测条件见表5,各成分的MRM色谱图见图3。

图3 宁夏枸杞叶生物碱类成分的MRM图

表5 各成分的质谱检测参数

2.2.5 线性关系、检测限、定量限考察 分别精密吸取“2.2.2”项下制备的系列混合对照品溶液,按照“2.2.3”和“2.2.4”项下条件进样测定,以对照品溶液浓度(ng·mL-1)为横坐标,峰面积为纵坐标绘制标准曲线,计算线性回归方程和相关系数r,分别为甜菜碱:y=46 859x-1 264 288(r=0.998 8);葫芦巴碱:y=60 701x+10 106(r=0.999 5),线性范围分别在2.11～540.00 ng·mL-1和0.70～45.00 ng·mL-1,并在S/N为3和10时记录LOD和LOQ:甜菜碱的LOD为0.073 ng·mL-1,LOQ为0.24 ng·mL-1;葫芦巴碱的LOD为0.10 ng·mL-1,LOQ为0.34 ng·mL-1。所有标准曲线在线性范围内均呈良好的线性关系。

2.2.6 精密度、重复性、稳定性考察 取混合对照品溶液,按“2.2.3”和“2.2.4”项下条件连续进样6次,计算各成分峰面积的RSD值,所有成分RSD值范围在1.60%～1.76%,表明仪器精密度良好;取G3样品6份,每份0.5 g,平行制备供试品溶液,分别按“2.2.3”和“2.2.4”项下条件进样分析,计算各成分含量的RSD值,所有成分RSD值范围在1.68%～1.90%,表明该方法重复性良好;取G3样品,分别于0、2、4、8、12、24 h进样测定,以各成分峰面积的RSD值考察其稳定性,所有成分RSD值范围在1.61%～2.24%,表明该方法样品稳定性良好。

2.2.7 加样回收率实验 取G2样品6份,精密称定,分别加入与样品中各成分含量等量的2种标品,按“2.2.3”和“2.2.4”项下条件进样分析,计算回收率和RSD值,结果见表6,所有成分回收率范围在99.93%～102.90%,RSD值范围在1.39%～3.58%,表明该方法回收率良好。

表6 生物碱类成分精密度、重复性、稳定性及加样回收率考察结果(%,n=6)

2.3 样品含量测定

2.3.1 黄酮类和酚酸类等成分含量测定 取“2.1.1”项下制备的供试品溶液,在相应条件下测定各化合物的峰面积并分别计算样品中各成分含量,结果见表7～8。17种成分中苹果酸、琥珀酸、绿原酸、5-O-阿魏酰奎宁酸、芦丁、山柰酚-3-O-芸香糖苷含量在果用和叶用宁夏枸杞叶不同成熟度样品间具有显著性差异(P<0.05)。果用和叶用宁夏枸杞叶均随着成熟度增加黄酮类和酚酸类成分总量逐渐减少,有机酸类成分总量逐渐增加。除原儿茶醛、对香豆酸、咖啡酸、槲皮素、芹菜素外,其余成分含量在同一品种不同成熟度或同一成熟度不同品种宁夏枸杞叶样品间均具有显著差异(P<0.05);槲皮素-3-O-芸香糖-7-O-葡萄糖苷含量在果用宁夏枸杞叶中不同成熟度间无显著差异,但在叶用宁夏枸杞叶中具有显著性差异(P<0.05)。东莨菪素在果用宁夏枸杞叶中叶芽含量最高,在叶用宁夏枸杞叶中其含量随着成熟度增加逐渐增加。

表7 不同成熟度宁夏枸杞叶中黄酮类成分的含量

表8 不同成熟度宁夏枸杞叶中酚酸类及其他类成分的含量

2.3.2 生物碱类成分含量测定 取“2.2.1”项下制备的供试品溶液,在相应条件下测定各化合物的峰面积,并分别代入标准曲线计算相应化合物的含量,结果见表9。不同成熟度宁夏枸杞叶随成熟度增加甜菜碱含量降低、葫芦巴碱含量先增加后降低。叶用宁夏枸杞叶的叶芽、幼叶和嫩叶的甜菜碱含量显著高于果用宁夏枸杞叶(P<0.05),而不同成熟度果用宁夏枸杞叶的葫芦巴碱含量均高于叶用宁夏枸杞叶。

表9 不同成熟度宁夏枸杞叶生物碱类成分的含量

2.4 宁夏枸杞叶抗氧化活性的评价

2.4.1 DPPH自由基清除能力的测定 DPPH自由基清除实验参照杨灵光等[17]的方法,用从标准曲线算得的相当于抗氧化剂Trolox的量表示样本的DPPH自由基清除能力(mg·g-1)。

2.4.2 ABTS自由基清除能力的测定 采用总抗氧化能力检测试剂盒(ABTS法)评价ABTS自由基清除能力。步骤参考试剂盒说明书,Trolox作为阳性对照,结果以mmol·g-1当量值表示。

2.4.3 Fe3+还原能力的测定 测定前分别稀释样品至同一浓度,然后根据FRAP试剂盒说明操作,得到样品吸光度以及标准曲线方程。样品的抗氧化能力以达到相同吸光度所需FeSO4的量(mmol·kg-1)来表示。

2.4.4 样品抗氧化活性评价 3种方法测得样品抗氧化活性结果见表10。4个成熟度的宁夏枸杞叶中嫩芽的3种抗氧化能力均较高。不同成熟度叶用宁夏枸杞叶中嫩叶的DPPH清除能力最高,叶芽的ABTS自由基清除能力和铁离子还原能力较强,其总体趋势均为随着成熟度增加抗氧化能力降低。果用宁夏枸杞叶芽的DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力和铁离子还原能力均较高,其余成熟度的果用宁夏枸杞叶的抗氧化能力差异不明显。

表10 不同成熟度宁夏枸杞叶抗氧化活性

2.4.5 宁夏枸杞叶成分与抗氧化性能相关性分析 采用Spearman相关性分析探讨宁夏枸杞叶中19种成分与其抗氧化能力的相关性,结果如图4。结果显示,DPPH自由基清除能力与琥珀酸含量(r=0.928 57)、隐绿原酸含量(r=0.857 14)、5-O-阿魏酰奎宁酸含量(r=0.809 52)、槲皮素-3-O-芸香糖-7-O-葡萄糖苷含量(r=0.738 1)、绿原酸含量(r=0.714 29)呈正相关。ABTS自由基清除能力与槲皮素-3-O-芸香糖-7-O-葡萄糖苷含量(r=0.904 76)、隐绿原酸含量(r=0.880 95)、甜菜碱含量(r=0.857 14)、绿原酸含量(r=0.833 33)、5-O-阿魏酰奎宁酸含量(r=0.690 48)呈正相关。铁离子还原能力与隐绿原酸含量(r=0.928 57)、槲皮素-3-O-芸香糖-7-O-葡萄糖苷含量(r=0.857 14)、新绿原酸含量(r=0.833 33)、甜菜碱含量(r=0.833 33)、绿原酸含量(r=0.809 52)呈正相关。总体来看,隐绿原酸、5-O-阿魏酰奎宁酸、槲皮素-3-O-芸香糖-7-O-葡萄糖苷、绿原酸、甜菜碱含量与宁夏枸杞叶抗氧化能力呈强正相关,推测是宁夏枸杞叶发挥抗氧化能力的主要活性物质。

图4 宁夏枸杞叶成分与抗氧化性能相关性热图(*P<0.05)

3 讨论

本研究结果显示,目前我国果用宁夏枸杞主栽品种宁杞7号和叶用宁夏枸杞主栽品种宁杞菜1号2个品种的叶片随着成熟度增加,黄酮类成分总量均显著减少,与文献报道茶叶中黄酮类成分变化趋势一致[18]。这是由于与叶片相比,芽中与类黄酮生物合成相关的黄酮醇合酶的表达水平较高,使黄酮类成分含量较高[19]。此外,果用宁夏枸杞叶及叶用宁夏枸杞叶均呈现随着叶片逐渐成熟其抗氧化活性降低的趋势,与其主要黄酮类和酚酸类成分含量变化趋势基本一致。有研究显示,枸杞属植物中含有的甜菜碱类物质具有较好的糖脂调节、神经保护等生物学活性[20],而2个品系宁夏枸杞叶均呈现随叶片成熟其甜菜碱含量显著降低的趋势。上述结果提示,在不考虑产量及采摘成本的前提下,以宁夏枸杞叶芽或幼叶作为茶饮或鲜蔬食用的保健价值更高。相同成熟度的叶用宁夏枸杞叶的抗氧化作用相对强于果用宁夏枸杞叶,提示叶用宁夏枸杞叶具有较高的保健价值,也进一步反映了目前发展叶用枸杞产业的科学性。

不同成熟度宁夏枸杞叶的主要成分指标及抗氧化能力相关性分析结果显示,隐绿原酸、5-O-阿魏酰奎宁酸、槲皮素-3-O-芸香糖-7-O-葡萄糖苷、绿原酸、甜菜碱含量与枸杞叶抗氧化能力呈强正相关性。有研究表明,隐绿原酸、5-O-阿魏酰奎宁酸、绿原酸、甜菜碱具有良好的抗氧化性能[21-23],与本研究结果基本相符。此外,在广东、广西及江苏等地也有采摘宁夏枸杞同属植物枸杞LyciumchinenseMiller的新鲜嫩茎叶作时蔬煲汤食用的习惯,其活性组分及保健作用值得进一步研究。

本文基于不同品系及不同成熟度宁夏枸杞叶中5种黄酮类、10种酚酸(醛)类、2种小分子有机酸类及2种生物碱类成分含量及抗氧化性能的研究,为深入揭示宁夏枸杞叶的利用价值及适宜采收时间提供了基础数据,为宁夏枸杞叶产品品质提升奠定了基础。