陈宪梅，吴涛，曲梦柔，于旭峰，孙春燕，毕迦琦，王杰琼，乔明琦✉

（1.山东中医药大学中医基础理论研究所，山东 济南 250355；2.山东中医药大学中医药经典理论教育部重点实验室，山东 济南 250355；3.山东中医药大学情志病证研究创新团队，山东 济南250355；4.山东中医药大学情志病证肝藏象药理青年科研创新团队，山东 济南 250355）

甲状腺结节是常见的甲状腺疾病之一，目前发病率逐年上升［1］，良性率较高，恶性结节不到10%，但常被过度治疗造成不可逆的损伤。因此减少因手术治疗带来的不可逆损伤，成为近年来甲状腺结节研究的新方向［2］。中性粒细胞促进肿瘤进展，而淋巴细胞抑制肿瘤进展［3］，此外感染和炎症是纤维化组织沉积的关键过程［4］。因此探究外用制剂“甲节减”是否具有抗炎效果从而辅助治疗甲状腺结节具有一定的临床诊疗价值。外用制剂“甲节减”治疗甲状腺结节有明显效果，但就其抗炎镇痛效果评价及抗炎机制并没有作进一步研究。炎症是众多疾病共同的病理表现，在进行药理学试验时须使用不同的实验模型［5］。因此本研究旨在采用经典急、慢性炎症模型及镇痛模型，探究中药复方外用制剂“甲节减”抗炎、镇痛效果及量效关系，以期为外用制剂“甲节减”进一步研究提供理论基础。

1 材料

1.1 实验动物

SPF 级雄性昆明（KM）小鼠（北京维通利华动物技术有限公司，动物生产许可证号：SDA0040003），体质量（20±2）g，于本单位动物实验中心饲养，饲养条件：恒温（22±2 ℃），恒湿（40±5）%，昼夜各12 h。

1.2 药物与试剂

连翘、浙贝母、夏枯草、煅牡蛎、黄芩、柴胡、牡丹皮和醋莪术（安徽百岁堂中药股份有限公司，批号：210301、210601、210301、200401、210801、210701、211101 和211101）；二甲苯（天津市富宇精细化工有限公司，批号：XK13011140001）；云南白药（三九医药股份有限公司，批号：Z53021103）；角叉菜胶（山东中森生物技术有限公司，批号：c804872）。

1.3 主要仪器

XIR 型离心机（赛默飞科技有限公司）；NPP-10000UL 型移液器（北京中西华大科技有限公司）；SpcctraMaxiD5 型全自动酶标仪（赛默飞科技有限公司）；SQP 型电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；BBS-SDC 型超净工作台型（济南鑫贝西生物技术有限公司）；75JA150317 立式压力蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械厂）；ER12-YLS 型鼠尾光照测痛仪（江苏赛昂斯生物科技有限公司）；DHG-9240A 型电热鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）。

2 方法

2.1 外用制剂“甲节减”的制备工艺

取配伍好的“甲节减”方剂500 g，10倍量蒸馏水浸泡过夜，次日8倍水量煎煮3次，每次1 h得水提物；取出药液备用，药渣中倒入蒸馏水5 L，煎煮提取2 次，每次1.5 h；合并药液并加入70%醇至1 225 mL，醇沉过夜。将醇提物置于旋转蒸发仪中加热回流，旋蒸萃取，浓缩至250 mL，生药浓度2 g/mL，即可关闭装置减压回收溶剂。按比例配取高、中、低浓度（20、10、5 mL/kg）梯度的“甲节减”药液各10 mL。

2.2 二甲苯致耳廓肿胀实验

SPF级50只健康雄性KM小鼠，自由饮食1周，根据体质量随机分为模型组、阳性药组（云南白药酊剂）和“甲节减”高、中、低剂量组（20、10、5 mL/kg），每组10只。各组小鼠每日1 次外涂相应药物于右耳耳廓处，“甲节减”高、中、低剂量组涂抹20、10、5 mL/kg“甲节减”，阳性药组涂抹云南白药酊剂10 mL/kg，模型组涂抹空白基质蒸馏水10 mL/kg。每日上午8：00不间断给药7 d，在末次给药2 h后，将0.05 mL 剂量的二甲苯均匀涂抹于每只KM 小鼠右耳耳廓前后，置于通风橱内自由活动30 min后，脱颈处死小鼠，用直径8 mm的耳廓打孔器在KM小鼠左、右耳耳廓等位处打下8 mm耳片并称量其重量，分别计算出各组的肿胀度及肿胀抑制率［6］。

肿胀度（mg）=右耳耳廓质量 -左耳耳廓质量

肿胀抑制率（%）=（模型组右耳耳廓肿胀度均值 -给药组右耳耳廓肿胀度均值）/模型组右耳耳廓肿胀度均值×100%

2.3 棉球致肉芽肿胀实验

2.3.1 棉球制作方法

术前将（5±0.5）mg的脱脂棉球用121 ℃高压灭菌锅灭菌30 min，灭菌完成后放入烘箱中60 ℃进行烘干。

2.3.2 棉球致肉芽肿胀实验步骤

小鼠称重后全身消毒，用浓度为1%的异氟烷进行呼吸麻醉。待小鼠麻醉后，用高压灭菌的手术器械对KM 小鼠进行棉球包埋手术，具体操作步骤如下：小鼠仰卧位，用无菌手术刀在其左膝下约0.3 mm处划开一小切口，将干燥灭菌的棉球植入小鼠膝下，并用75%酒精对伤口消毒。

实验分组及给药方案同“2.2”。待手术完成1 h后对各组小鼠进行涂抹给药。每日8：00 不间断给药7 d，每日1次外涂。第7天给药1 h后，将KM小鼠脱椎处死，取出之前包埋的棉球，去除多余脂肪组织，放入烘箱中60 ℃烘干至恒重，其重量减去棉球重量即为肉芽肿重量［4］。

2.4 小鼠血清中TNF-α 和IL-1β 抗炎因子含量的测定

实验分组及给药方案同“2.2”。采用ELISA 法定小鼠血清中细胞因子含量，末次给药2 h 后，眼球采血1 mL 置于1.5 mL 离心管中，血液静置于5 mL 离心管30 min，3 500 r/min 离心15 min，取上清，根据试剂盒说明书测定其血清中的抗炎因子（TNF-α、IL-1β）的含量［7］。

2.5 镇痛实验

将KM 小鼠距尾尖1/3 处用75%酒精擦拭，随后将相应药物涂抹于小鼠的尾部，0.5 min后固定于小鼠固定器内。将筒后盖中心孔穿出的小鼠尾部保持自然下垂，并放置于小圆棍上待小鼠保持安静后开始实验。鼠尾因光照热痛产生的瞬间抽痛甩尾反应即为阳性反应，给药前测试痛阈，以3～13 s为限，舍弃给药前痛阈＜3 s 或＞13 s 的小鼠。实验分组及其给药方案同“2.2”。给药7 d后，分别在0.5、1.5、2 h把小鼠放在光照测痛仪上，记录小鼠甩尾时长（甩尾时长＞16.5 s 的按16.5 s 处理）。基础痛阈的计量方式为给药前痛阈的3次均值，并进行统计学处理（q检验）［8］。

2.6 统计学方法

用SPSS22.0 统计学软件进行处理。计量资料用均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析。计数资料用［例（%）］表示，采用χ2检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 各组小鼠二甲苯致耳廓急性肿胀实验结果比较

小鼠耳廓急性肿胀模型中，各组间比较均无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 各组二甲苯致KM小鼠耳廓急性肿胀实验结果比较

3.2 慢性炎症实验

3.2.1 各组小鼠棉球致肉芽肿胀实验结果比较

与模型组比较，“甲节减”中、高剂量组的肉芽肿质量极显著降低（P＜0.01），表明“甲节减”中、高剂量组外用制剂均能有效抑制KM 小鼠肉芽肿胀程度。与阳性药组比较，“甲节减”中、高剂量组肉芽肿质量无统计学意义，说明“甲节减”的治疗效果与阳性药相当。见表2。

表2 “甲节减”外用制剂对KM小鼠肉芽肿的影响（±s）

表2 “甲节减”外用制剂对KM小鼠肉芽肿的影响（±s）

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

抑制率/%—43.56 44.78 51.26 32.05组别模型组阳性药组“甲节减”高剂量组“甲节减”中剂量组“甲节减”低剂量组n 10 10 10 10 10剂量/（mL/kg）10 10 20 10 5肉芽肿质量/mg 205.00±6.09 115.00±6.89 113.20±5.62**99.90±2.76**139.30±6.15**

3.2.2 各组小鼠血清中TNF-α 和IL-1β 含量的比较

与模型组比较，“甲节减”各剂量组血清中TNF-α含量比较差异无统计学意义（P＞0.05），但“甲节减”中剂量组有降低趋势，其原因可能与给药时间过短有关。“甲节减”中、高剂量组IL-1β 含量极显著降低（P＜0.01），说明“甲节减”中、高剂量组的抗炎效果与体内炎症因子含量的变化有关。与阳性药组比较，“甲节减”中剂量组TNF-α 有降低趋势，“甲节减”中、高剂量组IL-1β含量极显著降低（P＜0.01）。见图1。

图1 各组小鼠TNF-α、IL-1β含量比较

3.3 各组小鼠镇痛作用实验结果比较

与模型组比较，“甲节减”中、高剂量组小鼠给药后2 h痛阈有显著性升高，中剂量组差异最明显（P＜0.01，P＜0.05），说明甲节减外用制剂中、高剂量组对小鼠有镇痛效果，中剂量最优。与阳性药组比较，各给药组无统计学意义（P＞0.05），说明“甲节减”治疗效果与阳性药相当。见表3。

表3 各组小鼠痛阈的影响比较（±s）

表3 各组小鼠痛阈的影响比较（±s）

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

组别模型组阳性药组“甲节减”高剂量组“甲节减”中剂量组“甲节减”低剂量组给药后2 h/s 5.35±1.47 5.40±1.14 6.95±1.48*7.26±1.58**5.37±1.92 n 10 10 10 10 10剂量/（mL/kg）10 10 20 10 5给药前/s 5.59±5.50 5.35±3.10 5.36±3.08 5.28±3.24 5.20±2.67给药后0.5 h/s 5.80±1.66 4.86±1.09 5.39±3.53 6.45±2.30 5.19±1.22给药后1 h/s 5.89±2.65 6.68±1.39 6.23±2.13 6.00±0.81 6.10±0.57

4 讨论

“甲节减”中主要成分连翘酯苷、夏枯草油、丹皮酚、柴胡皂苷和黄芩素等均具有抗病毒、抗肿瘤及抗菌抗炎等多种功效［9-16］。本方君药为连翘，具有清热解毒、消肿散结之功，抗炎作用是连翘发挥消肿散结功效的主要药理作用之一［17］。柴胡中含有的柴胡皂苷C（SSc），与CNR2相互作用，能够激活抑制淋巴因子和血管生成因子的释放，从而影响炎症过程。黄芩中的成分白杨素能通过对TNF-α 的增敏作用抑制NF-κB 的活性进而发挥抗炎作用［12-13］。此外肿胀和炎性渗出是评估抗炎反应重要步骤和中心环节。二甲苯能够立即促使小鼠耳廓部位发生急性耳肿胀，本研究中发现“甲节减”可显著减少二甲苯引起的水肿，这种反应的抑制可能是消炎作用的迹象［5，18-19］。炎症反应亦可诱发疼痛，因此检测小鼠痛阈值可以反映小鼠炎症情况。受细菌、病毒等病原体侵袭或机体自身组织损伤的影响，可使体内产生TNF-α、IL-1β，因此检测TNF-α与IL-1β的含量可反映出机体的炎性程度，TNF-α与IL-1β含量越高，胰岛素抵抗越严重提示小鼠存在低度慢性炎症反应［7，20］。因此，通过检测机体肿胀程度，TNF-α和IL-1β 含量以及镇痛效果可反映机体的基本炎症状况。本实验证实“甲节减”中、高剂量组能有效抑制小鼠慢性炎症模型，中剂量组效果最好，且在小鼠慢性炎症模型中，“甲节减”中、高剂量组对小鼠慢性炎症的治疗效果与阳性药组相当。“甲节减”中、高剂量组均可降低小鼠血清中IL-1β 的含量，“甲节减”低剂量组血清中TNF-α与模型组比较无明显差异，但“甲节减”中剂量组有降低趋势。IL-1β 显著降低，提示“甲节减”能够起到预防炎症发生的作用，其主要抗炎机制与抗炎因子IL-1β含量有关。

本实验通过急慢性炎症模型分别评价甲节减的抗炎作用，结果表明“甲节减”对慢性炎症的治疗效果较好，但对急性炎症的治疗效果一般。此结果可能与本方君药为连翘有关。王婷婷等［21］分别建立急、慢性炎症两个模型评价连翘的抗炎效果，结果表明，连翘叶对耳肿胀抑制效果一般，但对棉球肉芽肿的抑制效果最好，与本实验结果相符。

本研究揭晓了中药复方“甲节减”外用制剂的抗炎、镇痛效果及量效关系，在抗炎效果的基础上进一步对其抗炎机制进行初步探究。不足之处为本研究主要从抗炎因子的角度探寻其抗炎机制，尚未进行相关通路层面的探究。后续将对“甲节减”抗炎机制相关通路进行深入研究，为临床研发治疗甲状腺结节的新药奠定前期基础。