朱思蓓, 聂晶, 李春霖, 邵圣枝, 张永志, 袁玉伟, 陶益, 王钫*

(1.浙江省农业科学院 农产品质量安全与营养研究所, 浙江 杭州 310021; 2.浙江工业大学 药学院, 浙江 杭州 310014;3.农业农村部农产品信息溯源重点实验室, 浙江 杭州 310021)

三叶青 (TetrastigmahemsleyanumDiels et Gilg)隶属于葡萄科崖爬藤属, 又名蛇附子、石猴子、金线吊葫芦等, 是我国特有的民间药用植物。三叶青以块根或全草入药, 具有抗肿瘤、消炎、解热、镇痛、免疫调节等功能[1]。根据根部藤表皮颜色差异可分为紫藤三叶青和青藤三叶青: 紫藤三叶青主要分布于纬度37.3°以北的江西、浙北地区; 青藤三叶青主要分布于我国纬度27.3°以南的福建、湖南、四川、广东、广西、云南的部分地区[2]。不同产地的三叶青化学成分和微量元素含量有所差异, 对临床疗效产生影响, 调查发现, 江浙地区的三叶青提取物在抑制癌细胞增殖、解热等方面较西南地区具有明显优势[3]。

因三叶青在抗肿瘤方面具有显著疗效, 其产业在近十年间有了迅速的发展, 但同时也出现了一些问题。传统中医理论均以三叶青块根入药, 导致三叶青地上部分的浪费, 降低了生物利用率[4]。此外, 随着市场需求的扩大, 野生三叶青资源被过度挖掘而人工栽培水平不足导致的引种混乱问题使得三叶青的药理活性大大降低, 影响了市场上三叶青的品质与价格。再者, 该药至今未被收录进 《中华人民共和国药典》, 无法以传统的中药材鉴别方法对三叶青建立统一的标准。因此, 需要通过有效的产地鉴别方法建立起完善的三叶青产地溯源体系, 以区分市场上不同产地的三叶青品种, 选用优质三叶青品种入药, 以提高临床疗效[5]。本研究综述了三叶青的有效成分、功效、产地情况, 介绍了可用于三叶青的多种产地溯源技术, 以期为建立有序的三叶青产地溯源体系提供参考。

1 化学成分

1.1 主要功能性成分

1.1.1 黄酮类化合物及其糖苷

黄酮类化合物及其糖苷是三叶青中的功能性成分之一, 也是目前研究得较为系统的一类化合物。黄酮类主要存在形式为黄酮类、黄酮醇类、黄烷类、二氢黄酮类及其糖苷, 少量以异黄酮类的形式存在[6]。孙梦佳等[7]通过三叶青的乙醇冷浸液进行UPLC-Q-Exactive 获取分析数据, 采用MDF 筛选方法共鉴定出金丝桃苷、紫云英苷等41 个黄酮类化合物。邓思珊等[8]通过超高效液相色谱-串联质谱对三叶青叶化学成分进行鉴定, 鉴别出了异荭草素、荭草素、牡荆素鼠李糖苷、牡荆素、异牡荆素等5 种成分。孙崇鲁等[9]运用超高效液相色谱-电喷雾四级杆飞行时间质谱对三叶青地上部分进行分析, 鉴别出了槲皮苷、山柰苷、芦丁等22 个黄酮类化学成分。

黄酮类化合物具有抗肿瘤、消炎、解热、镇痛、抗氧化等功能, 因此, 作为三叶青药理药效研究的一大重点[10]。林钰久等[11]研究证明, 三叶青黄酮可明显降低荷Lewis 肺癌小鼠Treg 细胞比例,提高免疫功能, 抑制移植瘤的生长, 可用于临床抗肺癌的治疗。汪正飞等[12]通过对三叶青总黄酮对人肝癌细胞HEPG-2 裸鼠异种移植瘤生长体积和生长情况的研究, 证实了其具有抗肝癌的作用。杜闯研究表明, 三叶青总黄酮可能通过将细胞周期阻滞于G0/G1期, 调节Wnt/β-catenin 信号通路相关蛋白的表达的机制来抑制乳腺癌细胞MCF-7增殖和侵袭。廖淑彬等[14]通过小鼠耳、足肿胀急性炎症模型验证了总黄酮类化合物的消炎作用, 同时用扭体法和热板法验证了总黄酮类化合物的镇痛作用。黄真等[15]通过干酵母制热法和2, 4-二硝基苯酚致热法等验证了三叶青提取物具有一定的解热作用。

1.1.2 多糖

多糖是广泛存在于植物、动物和微生物中的重要天然化合物之一, 起着至关重要的作用, 也是三叶青的另一类功能性成分。訾豪然等[16]用PMP 柱前衍生化-HPLC 法和化学计量学分析测定了三叶青中单糖含量与组成比例, 建立了三叶青多糖图谱, 结果表明, 三叶青中甘露糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖的含量较高。饶君凤等[17]通过离子色谱-脉冲安培法 (IC-PAD) 测得三叶青块根和叶中多糖均含有岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖这6 种单糖组分。

目前对多糖的药理活性研究还是不够深入, 主要集中在其抗肿瘤作用和抗氧化活性方面: 郭南通过实验证明, 三叶青根多糖RTP 可能通过降低细胞线粒体膜电势的线粒体途径诱导细胞凋亡来显著抑制人胃癌SGC-7901 细胞的增殖。银喆通过维生素C、BHT 以及黄芪多糖、枸杞多糖作为三叶青多糖的对照说明了三叶青多糖同样具有抗氧化的功能。李萍等[20]通过建立小鼠免疫性肝损伤模型进行实验, 说明多糖抗免疫性肝损伤的作用可能与纠正机体Treg/Th17 免疫失衡有关(表1)。

表1 文献中已知的三叶青主要功能性成分

1.2 其他功能性成分

1.2.1 酚酸类

酚酸类化合物也是一种重要的植物化学物质,具有广泛的生理活性, 包括抗氧化、抗炎和抗肿瘤活性等。李江等[21]通过对三叶青藤乙醇提取液的正丁醇部位的分离纯化得到了没食子酸等酚酸化合物。Sun 等[22]通过不同溶剂首次从三叶青中提取出绿原酸、新绿原酸、1-咖啡酰奎宁酸、对香豆酰奎尼酸等13 种酚类化合物。同时三叶青中还存在对 水 杨 酸、丁 香 酸、香 草 酸、异 香 草 酸 等 化合物[23-24]。

1.2.2 萜类及甾体类化合物

萜类及甾体类化合物同样作为非常重要的植物成分。目前在三叶青中发现了蒲公英萜酮、蒲公英萜醇等三萜类化合物以及β-谷甾醇、麦角甾醇、胡萝卜苷、6′-O-苯甲酰基胡萝卜苷等甾体类化合物[25]。β-谷甾醇具有明显的降胆固醇、降血糖、镇咳、抗癌、抗炎等药理作用[26], 具有很高的药用价值但由于其含量在植物体内过低, 在药物开发及临床应用较为少见, 需引起我们的重视。

1.2.3 挥发油和脂肪酸类化合物

挥发油和脂肪酸类化合物也广泛存在于三叶青中。徐硕等[27]通过硅胶柱色谱、凝胶柱色谱等色谱分离方法对三叶青进行分离得到-羟基-10, 12-十八碳二烯酸、(4R, 5R) -4-羟基-5-异丙基-2-甲基环己-2-烯酮、(4S, 5R) -4-羟基-5-异丙基-2-甲基环己-2-烯酮、(3R, 4R, 6S) -3, 6-二羟基-1-薄荷烯等4 个化学成分。张煜炯等[28]利用GC-MS 的分析方法鉴别出了2-癸烯、2-烯丙基-6-甲基苯酚等53 个挥发性成分 (表2)。

表2 文献中已知的三叶青中其他功能性成分

2 产地溯源技术

2.1 中药指纹图谱技术

中药指纹图谱是通过一定的分析方法研究某些中药材和中药制剂并得到能够标示其化学特征的色谱图或光谱图的一种鉴定手段, 具有专属性强、稳定性好、重现性好的特点[29]。常用的中药指纹图谱技术有光谱指纹图谱法和色谱指纹图谱法两种。三叶青作为 “新浙八味” 之一, 其有效化学成分黄酮类和多糖类具有抗肿瘤、抗癌的功效, 可用近红外光谱技术和高效液相色谱技术对其有效活性成分进行测定, 以鉴别出不同产地的三叶青。

2.1.1 光谱指纹图谱法

常用的光谱技术有紫外-可见光谱技术、红外光谱技术、拉曼光谱技术、荧光光谱技术、核磁共振光谱技术等[30]。李颖[31]利用近红外光谱技术获取了来自浙江、福建、云南、湖南、贵州等5 个产地的三叶青在4 000～10 000 cm-1的近红外图谱,并定量地分析了黄酮和多糖的含量, 在分析时构建了PLS-DA 分类器模型和PLS 模型以提高不同产地三叶青样品鉴别的准确度。李颖[31]的实验说明了近红外光谱技术可以准确地判别出不同产地的三叶青, 并对三叶青中的黄酮、多糖类有效成分进行准确的定量分析, 为建立三叶青的品质评价体系提供了一定的理论基础。

2.1.2 色谱指纹图谱法

常见的色谱指纹图谱法有高效液相色谱法、气相色谱法、质谱法等。高效液相色谱技术可以通过对有效活性成分含量的测定建立指纹图谱来对不同产地的中药材进行溯源判别。朱烨婷等[32]通过收集8 个省20 个产地的三叶青样品进行超高相液相色谱法测定化学成分芦丁、异槲皮苷与山柰酚-3-O-芸香糖苷的含量, 结果表明, 三叶青中黄酮苷含量从高到低依次是重庆、福建、广西、贵州、浙江、湖北、湖南、江西; 同时广西、重庆、福建等经纬度低、海拔高的地区更加有利于其块根中黄酮苷含量积累, 在市场上可以优先选用。朱建丽[33]和李飘[34]都通过HPLC 发现, 不同产地下三叶青中的绿原酸、咖啡酸、荭草苷、紫云英苷、槲皮素、白藜芦醇、山柰酚等有效活性成分的含量有所差异, 为三叶青药材的质量控制提供参考。李鹤收集了从浙江、福建、贵州、广西、湖南等5 个地区采集的三叶青样品利用HPLC 建立指纹图谱, 进行聚类分析和主成分分析的结果显示, 广西三叶青和湖南三叶青的品质较为接近, 浙江三叶青与贵州三叶青、福建三叶青的品质相差较大。

2.2 矿物元素产地溯源指纹分析技术

矿物元素指纹分析图谱技术的原理是根据不同产地的土壤因与岩石风化的母质存在一定的相关性, 进而使不同产地的土壤中矿物元素的种类及含量有着地质特异性差异, 包括常量元素、微量元素和痕量元素三类。矿物元素指纹分析图谱可以通过对不同产地样品的矿物元素进行组成和含量分析,利用方差分析、判别统计分析等数学统计方法筛选出来的有效信息进行产地判别[36], 常见的矿物元素指纹图谱分析方法有电感耦合等离子体质谱法、紫外-可见分光光度法、仪器中子活化法等, 在中药材产地溯源中得到了广泛的应用。吴浩等[37]通过电感耦合等离子体质谱法对三叶青的27 种矿质元素进行含有量测定, 测定结果显示, 三叶青中K、Mg、Ca、Al、Fe、Mn 平均含有量较高并且西部地区与东部地区的矿质元素含量差异较大, 广西的三叶青样品与其他产区三叶青的矿质元素含量差异最大, 主成分和载荷分析的分析结果也可以将各个产地的三叶青进行区分。江川等[38]通过等离子发射光谱法测定不同产地三叶青中As、Cu、Hg、Cd、Pb 五种重金属的含量, 测定结果显示, 不同产地的三叶青重金属含量有所差异, 其中重庆的三叶青样品Cd、Pb 含量较高, 广西桂林的三叶青样品As 含量较高。重金属一旦进入人体就会在人体器官中逐渐积累造成慢性中毒, 危害人体健康, 因此, 通过矿质元素检测进行产地溯源来规范三叶青重金属含量是十分重要的。同时有研究[39]表明,微量元素与肝癌也具有一定的相关性, 其贡献程度依次为Zn、Mn、Cu、Fe、Mg, 而恰好三叶青中的Mg、Fe、Mn 含量较高, 由此可以推测, 微量元素的差异可能会对三叶青抗肝癌疗效产生影响。综上所述, 对三叶青进行矿物元素产地溯源指纹分析能更加准确地鉴别出三叶青的产地, 可以建立起更完善的一套三叶青质量控制体系。

2.3 稳定同位素分析技术

稳定同位素分析法是通过同位素比率质谱仪实现的, 利用同位素分馏效应理论实现对碳、氢、氧、氮、硫等元素的同位素在体内富集程度的计算来进行示踪[40]。其中碳同位素主要与光合作用的途径有关; 氢和氧的同位素主要与环境海拔、降水量等有关; 氮同位素的差异则取决于在肥料中氮元素含量的高低[41]。在中药材产地溯源中, 矿物元素分析方法与稳定同位素分析方法通常联合使用以增强其溯源的准确性。

2.4 分子生物技术

分子生物技术可分为DNA 分子遗传标记技术和mRNA 差异显示技术。前者根据DNA 的差异进行判别, 后者是通过寻找不同的组织或者细胞在基因表达中的差异进行判别[42]。沈清[43]通过对不同产地的5 个三叶青完整叶绿体基因组序列进行基因组结构特征和序列变异分析, 成功揭示了其结构的变化; 并根据已确定的叶绿体基因组发展出了DNA 条形码, 能高效地识别出不同产地的三叶青,为三叶青的鉴别提供了新的思路和方法。分子生物技术鉴别三叶青的优点是不容易受到生长环境、生长状况以及不同发育阶段的影响, 只与三叶青本身的遗传序列有关, 因此, 可以更加准确地对三叶青进行鉴别 (表3)。

表3 常见的产地溯源技术

3 总结与展望

本文对三叶青的化学成分、药理活性, 以及产地鉴别技术进行了论述。三叶青的产地分布广, 不同产地间的三叶青临床药效具有差异。这与当地栽培环境, 如光照、降雨、海拔、土壤等因素息息相关。此外, 随着人工栽培三叶青的技术发展, 不同的栽培方式也会致使活性成分的差异, 但鲜有相关的研究报道。由于三叶青的研究起步较晚, 有效成分和作用机制尚不清楚, 目前报道的主要的活性成分包括黄酮类和多糖类等。在品质评价方面, 可按照三叶青的根、茎叶、果实中的活性成分构建初步质量控制方法和分级标准, 按需选择合适的药材,保证临床用药的有效性。另外, 现有三叶青的产地鉴别技术主要集中在传统的色谱法和光谱法, 可引入和探讨其他的产地保护技术如稳定同位素与矿质元素技术对三叶青产地的区分准确度, 对中药材产业的健康发展具有重要意义。