高 帆， 冯 佳， 谢树莲

（山西大学a.生物学国家级实验教学示范中心；b.教务处；c.生命科学学院，太原 030006）

0 引言

大学生创新创业训练计划（简称“大创计划”）是教育部“两个工程”的重要建设内容，计划自2012 年起在国内高校全面实施，本着“兴趣驱动、自主实践、重在过程”的原则，旨在驱动高校人才培养模式改革，强化当代大学生创新创业能力训练，提高大学生的创新精神、创业素养和创新创业能力，从而全面提高人才培养质量［1］。

生命科学是以实验和实践为基础的学科，生物科学专业作为该学科人才培养的重要专业，强调理论与实践相结合［2］（山西大学国家级一流本科专业建设点）。实验教学始终贯穿国内高校生物科学本科教育的全过程。实验教学质量的好坏直接关系生物科学专业学生人才培养质量的高低。实验教学改革是提高本科生专业素养、实践技能、设计分析与能力，进而提升人才培养质量的重要手段［3］。将大创计划融入实验教学课程，是实现计划反哺教学，推动本科高校实验教学改革发展的有效途径之一。

现依托2012 ～2022 年间立项的国家级、省级大学生创新创业训练计划中涉及实验技术与方法创新的10 个项目，将其与学校生物科学专业开设的5 门专业基础实验课和5 门专业实验课（包括：植物学、动物学、动物生理、生物化学、遗传学、微生物学、细胞生物学、分子生物学、基因工程、生物医学等实验）有机融合，通过教学实践与效果反馈，探索该教学改革方式在本科实验教学运行中的可行性与必要性。

1 生物科学专业大创计划实施现状

我校自2007 年实施国家大学生创新性实验计划项目（2012 年更名为国家级大学生创新创业训练计划）［4］，历经15 载，学校已形成国家级、省级、校级大学生创新创业计划项目管理体系。2021 年，为了进一步完善本科实践教学管理，学校修订了“山西大学大学生创新创业训练计划管理办法”（山大教字［2020］22 号），从项目管理、经费分配、成果认定等方面进行了制度完善。生物科学专业15 年来共立项大创计划615 项，按项目级别分：国家级15 项，省级30 项，校级602项；按项目类型分，创新训练项目582 项，创业训练项目18 项，创业实践项目2 项（见图1）；入选教育部“国创计划”年会2 项，结题验收通过率平均95.8%。现从大创计划中遴选已用于本科实验课程教学改革与实践的项目进行介绍。

图1 山西大学生物学国家级实验教学示范中心2007 ～2022年生物科学专业大创计划立项数（2007 ～2011 年为原“国家大学生创新性实验计划”）

2 生物科学专业实验教学改革内容

2.1 植物学、植物生理学实验教学改革

基于《植物学实验》（高等教育出版社）实验九——原核藻类和真核藻类，补充绿藻门代表性种类小球藻形态学鉴定的设计性课改内容；基于《植物生理学实验教程》（科学出版社出版）第三篇——综合性、设计性与研究性实验，补充小球藻中性脂含量测定的设计性课改内容。该课程改革依托山西大学2016年大创计划——产油绿藻的筛选及其油脂积累研究，凝练计划项目核心研究成果，增加以上2 门课程的设计性实验教学内容。通过本实验项目的学习，学生可增强对低等藻类植物的形态学认识，教师可通过启发式教学手段，引导学生将无机化学、有机化学相关实验内容应用于功能藻的脂类等重要生理指标的检测，有助于其进一步深入理解与掌握不同物种关键生理指标的测定方法。

实验选取普通小球藻（Chlorellasp.）［5］为实验材料，光学显微镜下对小球藻的细胞形态进行观察［见图2（a）］；提取藻株的基因组DNA，设置rbcL 基因序列扩增体系并进行PCR扩增，扩增序列经测序后用NJ算法构建小球藻rbcL序系统进化树；依据形态学及系统进化树结果，鉴定该小球藻的种类为C. vulgaris。

图2 小球藻显微形态及不同盐度胁迫下总脂含量测定

取10 mL小球藻液于离心管中8000 r/min离心5 min，取出后弃上清，加入氯仿2 mL、甲醇4 mL，混匀后用超声波破碎仪破碎10 min，再次同等条件离心，之后取上清液于试管中；下层沉淀重复以上操作，直至藻粉呈白色。上清液中加入蒸馏水静置可见分层，上层为甲醇与水相，下层为氯仿相，用滴管小心吸取上层液（甲醇与水相）；将试管置于60 ℃烘箱中蒸发下层液中的氯仿及水分后，烘干称重。按以下公式计算总脂含量及总脂产率：总脂含量（%）=所得油脂重量（mg）/干重（mg）×100%。由生理实验结果可知［见图2（b）］，随着盐度的升高，小球藻的总脂含量先升高后降低，在1 g/L 盐浓度下，小球藻的总脂含量最高，达53.89%。

2.2 动物学、动物生理学实验教学改革

基于《动物学实验教程》（科学出版社）实验十二——昆虫分类，补充飞蝗的前胸腺解剖学演示性实验；基于《动物生理学实验》（高等教育出版社）第三部分——综合实验，增加RNA沉默LmCYP307A1 对飞蝗蜕皮激素合成影响的研究性实验。该课程改革依托山西大学2015 年大创计划——RNA 沉默Halloween 基因家族对飞蝗蜕皮激素合成的影响，选取该项目研究的阳性实验案例，分别增补进以上2 门课程的演示性和研究性实验教学内容中。教师可利用现代信息技术手段，通过显微互动、虚拟仿真等可视化、形象化的方式将该课程内容进行讲授。通过本实验项目的实施，学生可进一步掌握昆虫解剖方法、蝗虫组织器官识别、蝗虫发育过程理解及利用转录组测序数据对生理相关目标基因进行表达量分析等。

实验选取飞蝗（Locusta migratoria）［6］作为实验材料，用解剖剪从飞蝗腹部末端开始，沿其背中线偏左位置向前剪开虫的体壁，再用镊子将腹部胸腺取下放入盛有超纯水的盘中，肉眼观察其胸腺形态；取洁净载玻片，滴上清水，用解剖剪沿前胸腺位置剪开部分组织，用镊子取虫体前胸腺组织放入水滴中，盖上盖玻片进行显微观察。由解剖形态观察结果可知（见图3），飞蝗的前胸腺位于头、胸间隔，头颈断面头部一侧，呈飘带状，形态随着龄期和日龄变化明显。

图3 飞蝗前胸腺解剖观察（左侧红色箭头指向前胸腺位置，右侧为放大20倍镜下的光学显微照片）

分别对飞蝗五龄若虫进行dsRNA的注射，依据前期项目研究团队已获得的转录组测序数据集，对Halloween基因家族［7］的CYP307A1 基因进行五龄第2、5、8 天，成虫第2 天胸腺组和对照组的基因含量分析。结果发现实验组中的RNA 沉默后该基因的表达量远高于对照组，其中样本N5D5_PG（五龄第5 d）中基因的表达极显著（见表1），通过表型进一步观察发现该时期虫体的蜕皮困难，甚至出现畸形虫体，这间接表明CYP307A1 基因对飞蝗蜕皮激素的合成起正向调控作用。

表1 飞蝗CYP307A1 基因在前胸腺的qRT-PCR相对表达

2.3 微生物学实验教学改革

基于《微生物学实验》（高等教育出版社）第三篇——研究性实验，增加辣椒溶杆菌对樱桃叶枯菌拮抗作用分析的研究性实验教学内容。该课程改革依托山西大学2021 年大创计划——细菌菌株C09 高效拮抗樱桃叶枯菌的作用机制，遴选该研究项目中辣椒溶杆菌C09 对6 株樱桃叶枯病原菌的拮抗研究部分，补充进该课程的研究性实验项目中。教师可通过讨论式、探究式教学手段，将该微生物学实验基础实验技术、流程融入课程内容中，以规范微生物无菌化实验操作为首要教学目标。通过本实验项目的学习，学生不仅可巩固细菌、真菌基础知识，还可训练学生在细菌/真菌培养、培养基配制、涂菌、抑菌分析等方面的操作。

本实验所用细菌C09 经16S rDNA 测序和系统发育分析鉴定为辣椒溶杆菌属；所用的植物病原细菌（Bacillussp. ZQX、Bacillussp. Z713、Bacillussp. Z7、Bacillussp. SB）和植物病原真菌（Fasuriumsp. JK、Fasuriumsp. ZQ）经前期研究验证可导致樱桃叶枯病［8］。将病原细菌分别接种到R2A培养基、病原真菌分别接种到PDA培养基中，28 ℃，180 r/min摇床培养36 h，收集菌液备用；吸取20 μL 菌液分别加入到20 mL R2A或PDA固体培养基中，迅速振荡混匀后倾倒平板，培养基凝固后用镊子将已灭菌牛津杯垂直放置到培养基表面，静置10 min 后按序依次加入50 μL C09 菌液及50 μL R2A或PDA 液体培养基；静置3 h后，28 ℃恒温培养箱培养5 天观察抑菌圈情况［见图4（a）］。抑菌圈直径测量结果显示［见图4（b）］，辣椒溶杆菌C09对6株常见的樱桃叶枯病原细菌和真菌均有良好的拮抗活性，拮抗大小顺序分别为：Fasuriumsp. JK ＞Fasuriumsp.ZQ ＞Bacillussp. Z7 ＞Bacillussp. Z713 ＞Bacillussp. ZQX ＞Bacillussp. SB。

图4 C09对樱桃叶枯病菌的拮抗检测

2.4 细胞生物学、遗传学实验教学改革

基于《细胞生物学实验》（高等教育出版社）实验13——细胞吞噬运动的观察，增加嗜热四膜虫细胞对纳米TiO2吞噬作用观察的演示性实验教学内容；基于《遗传学实验》（北京师范大学出版社）实验3——动物生殖细胞减数分裂标本的制备与观察，增加了纳米TiO2暴露下的嗜热四膜虫细胞形态及核发育观察的设计性实验教学内容。该课程改革依托山西大学2020 年大创计划——基于嗜热四膜虫［9］分析纳米TiO2对减数分裂的影响，将其中涉及细胞形态观察及有性生殖过程观察的内容融入实验课程项目中。教师可以经典案例的方式将涉及细胞实验与遗传实验的内容进行综合，着重考查学生对不同种类生物细胞形态的认识与特定细胞功能的理解。学生通过该实验项目的学习，可进一步增强对于原生动物细胞形态的认知，学会使用激光扫描共聚焦显微镜，了解水污染毒素纳米TiO2对水环境指示性生物四膜虫生长发育的影响。

取活化的四膜虫细胞200 μL，血细胞计数板计数后转接混匀的细胞液至10 mL 培养基中（细胞终浓度：0.5 ×106个/mL），设置空白对照组以及纳米材料实验组。将各组恒温摇床30 ℃，80 r/min培养，在12、24、36、48 h分别取样计量分析，利用激光扫描共聚焦显微镜进行观察。由图5（a）～（c）可知，纳米TiO2平均粒径为（34.29 ± 12.37）nm，纳米TiO2可与嗜热四膜虫细胞膜吸附，被四膜虫吞噬进入胞内。

图5 纳米TiO2 对嗜热四膜虫细胞生长与发育影响

取活化的四膜虫细胞200 μL 转于10 mL SPP 培养基中，30 ℃孵育24 h 后将10 mL 培养液3500 r/min 离心5 min，去上清后加入10 mL Tis-HCL，3500 r/min离心5 min，洗去培养基，取10 mL虫液饥饿24 h，再添加100 μg/mL纳米TiO2，2、4、6、8、10、12、24 h 分别取样计数。在激光扫描共聚焦显微镜下，样本加入5 μL DAPI后观察虫细胞核发育情况并计数。由图5（d）可知，不同浓度的纳米TiO2在处理时间内，都会对四膜虫细胞生长产生抑制作用，表现出剂量-效应关系（纳米颗粒浓度升高，细胞数量越少；处理时间越长，细胞数量越少）。四膜虫有性生殖一般在24 h 结束，最终细胞核发育为两大一小形态。通过对比分析发现［见图5（e）］，实验型与野生型四膜虫的单细胞比例相似，细胞核发育形态一致性占比也较为相似，暗示该纳米材料仅延缓了四膜虫发育，但不会对其有性生殖过程产生影响。

2.5 生物化学、分子生物学实验教学改革

基于《生物化学实验》（高等教育出版社）第四章实验14——植物基因组DNA 提取，增加以油菜为实验材料的基因组DNA提取的验证性实验教学内容；基于《分子生物学实验指导》（高等教育出版社）第二篇实验五——DNA重组，增加油菜启动子napA 的克隆及转化的研究性实验教学内容。该课程改革依托山西大学2013 年大创计划——油菜种子特异启动子NapA的克隆及在油菜中的转化，将项目成果中油菜基因组DNA提取及其启动子NapA 序列［10］扩增、连接T-载体、转入E. coil DH5α菌株的内容融入本实验课改内容。教师可以分步式、设计式教学手段，将本实验教学内容进行设计与分解，设立各步的实验小目标，锻炼学生的逻辑思维能力。通过该实验项目的学习，学生可巩固植物基因组DNA提取的方法步骤，通过实例设计与实践，加深对外源DNA转化与重组的认识。

取油菜新鲜幼苗叶片5 或6 片，洗净后用CTAB法提取基因组DNA［11］。每个DNA 样品取5 μL 进行琼脂糖凝胶电泳。由图6（a）可知，CTAB 法提取的油菜基因组DNA片段较完整，可用于进一步实验操作。

图6 油菜启动子NapA扩增及其转化

根据GenBank 中NapA（X17542.1）的序列信息，设计特异引物对（上游引物： 5′-CGCGGATCCATACCATCTGATCATATCC-3′，下游引物：5′-AACTGCAG TTGCTCGAATACTAAATC-3′）。以油菜基因组DNA 为模板，按照表2 所示PCR 扩增体系进行反应溶液配制，PCR 仪上设置反应程序（94 ℃4 min、94 ℃30 s、60 ℃30 s、72 ℃2 min、72 ℃8 min、4 ℃10 min）进行NapA片段扩增。凝胶电泳结果显示该片段成功克隆［见图6（b）］。将NapA 片段进行胶回收，回收片段连接到T-载体，再将转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，阳性菌落进行质粒DNA 扩增［见图6（c）］。将凝胶电泳阳性转化子进行测序验证。酶切法将NapA 片段从T-载体、35S 启动子从pCaMBIA1301 上分别切下，回收NapA 和pCaMBIA1301 载体，连接酶作用下，将二者连接，构建植物表达载体Pcambia1301-NapA［见图6（d）］。将表达载体pCAMBIA1301-NapA转入到土壤农杆菌中，用农杆菌侵染油菜种子，在种子萌发时进行GUS基因表达的组织化学染色分析。结果显示［见图6（e）］，种子有蓝色反应，表明该启动子在油菜种子中特异表达。

表2 油菜NapA PCR扩增体系

2.6 医学生物学实验教学改革

基于《医学生物学实验》（科学出版社）第四篇探究性实验，增加1 个肺炎克雷伯菌耐药性实验的研究性实验教学内容。该课程改革依托山西大学2019 年大创计划——耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌的耐药机制研究，将项目研究成果中的创新方法——改良的Carba NP法用于鉴定菌株是否产碳青霉烯酶［12］，再利用药敏纸片扩散法（K-B 法）［13］检测菌株对不同抗生素的敏感性。教师可尝试翻转式教学方式讲授该实验课程内容，学生通过自主设计、搭配抗生素种类，进行比较对照实验，自主判断并报告实验结果，教师对结果进行分析反馈。通过该实验项目的学习，学生可进一步掌握酶学实验中酶活检测的不同方法以及菌株耐药性实验的操作技术。

将前期经16S rRNA 鉴定为肺炎克雷伯菌［14］的10 株菌株（分别命名为K1，K2，…，K10）在BHI 液体培养基培养，16 h 后取出；用药敏纸片扩散法检测肺炎克雷伯菌对10 种常见抗生素（孢唑林、头孢他啶、亚胺培南、环丙沙星、阿米卡星、阿奇霉素、四环素、磷霉素、氯霉素、复方新诺明）的药物敏感性。检测结果显示（见表3），10 株肺炎克雷伯菌对头孢唑林、头孢他啶、亚胺培南、环丙沙星、阿米卡星均100%耐药，对阿奇霉素的耐药性为40%、四环素60%、复方新诺明60%，对磷霉素显著敏感（100%不耐药），对氯霉素耐药性无法准确判断。

表3 肺炎克雷伯菌对抗生素敏感性检测结果

改良后的Carba NP法操作步骤：取20 μL甘油菌接种于3 mL BHI肉汤中（含1.5 μL 2μg/mL美罗培南），37 ℃下200 r/min 培养18 h；取上述菌液20 μL稀释100 倍，同样条件继续培养至OD600检测值在1.0至1.4；取2 mL菌液4 ℃5000 g 离心5 min，弃上清后用预冷的Tris-HCL（pH =7.8）洗菌两次后重悬于500 μL Tris-HCL；冰上裂解菌体，12000 g 离心5 min后取上清；将50 μL上清分别加入底物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ的检测孔内，吹打混匀后置于37 ℃温箱孵育1 ～2 h，期间注意底物颜色变化。结果显示（见图7），K1 ～K10 底物Ⅱ和Ⅳ均变为黄色，表明10 株肺炎克雷伯菌均可产生A类碳青霉烯酶（产碳青霉烯酶的一种），而早有研究显示［15］，产碳青霉烯酶是肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗生素产生耐药的主要原因。

图7 改良后的Carba NP试验结果

3 生物科学专业实验教学改革实践与实施成效

基于学校生物学国家级实验教学示范中心10 年来的大创计划实施成果，我们将上述典型实验教学改革项目与生物科学专业实验课程深度融合，以培养高质量生命科学人才为目标，构建了依托大创计划的“四位一体”（选题优化、内容衔接、分阶施教、动态调整）生物科学专业实验教学改革体系（见图8）。

图8 示范中心生物科学专业实验教学改革体系

2012 ～2022 年，参与示范中心实验教学改革实践的学生共538 人，授课教师17 人（其中高级职称11人，中级职称6 人），实验教学改革项目累计实施2675人次，实验总数1852 人时。通过对示范中心学生的问卷调查、成绩合格率、升学就业情况间接反映该实验教学改革举措的实施效果。据统计，平均98.17%的学生反馈教学良好，实验课程成绩合格率平均达90.66%，升学率平均达26.71%，一次性就业率平均达71.73%。目前，学校示范中心实验教学改革模式已在山西师范大学、太原师范学院、长治学院等进行推广，部分研究成果已被山西省农科院、青岛艾欣生物科技有限公司等单位应用，反馈效果良好；2 个项目入选教育部国家级大学生创新创业年会，4 个项目获得全国大学生生命科学竞赛一等奖，实施成效明显。

4 结语

山西大学生物学国家级实验教学示范中心依托大创计划，深入推进生物科学专业学生的创新创业训练，将大创计划重要研究成果与本科实验教学有机融合，构建“四位一体”的生物科学专业实验教学改革体系，驱动高校“以创促学，以创促教”，以点带面，全面深化学校实验教学改革创新。在新时代“四新”建设背景下［16］，该教学改革模式为国内高校培养当代大学生科学素养精神、创新实践能力、科研训练技能等方面提供了有益的借鉴。