吴丹，胡建平，甘椿椿

1 衢州职业技术学院医学院 浙江衢州 324000

2 黑龙江中医药大学 黑龙江哈尔滨 150006

3 教育部北药基础与应用研究重点实验室 黑龙江哈尔滨 150006

4 黑龙江省中药及天然药物药效物质基础研究重点实验室 黑龙江哈尔滨 150006

高血压是一种常见的慢性病，也是导致心脑血管疾病最主要的危险因素，多发于中老年人、肥胖者与长期饮酒人群[1-2]。高血压是指以体循环动脉血压（收缩压和、或舒张压）增高（收缩压≥140 mmHg （18.6 kPa），舒张压≥90mmHg （12 kPa））为主要特征，同时可伴有脑、心、肾等器官的功能或器质性损害的临床综合征[3-4]。欧洲高血压学会和心脏病学会指出，利尿剂、β 受体阻断剂、钙拮抗剂、血管紧张素转化酶抑制剂和血管紧张素受体阻断剂均可作为高血压病治疗的起始及维持用药[5]。但也存在一定的安全隐患，例如氢氯噻嗪等利尿剂，可引起低钾血症，血脂、尿酸代谢异常[6]；β 受体阻滞剂如美托洛尔等，可引起窦性心动过缓、支气管哮喘等禁忌[7]；钙拮抗剂如硝苯地平等，可引起心率增快、下肢水肿等[8]。

中药治疗高血压类疾病具有多成分、多靶点、多层次、疗效稳固和安全性高等特点，相对于单用西药有着较明显的优势，尤其是在症状改善方面效果更为突出[9-10]。川牛膝是国家卫计委公布的可用于保健食品的一味中药，具有逐瘀通经，通利关节，利尿通淋之功，不仅在多味中药配伍治疗高血压疾病方面使用频率较高，单用川牛膝也同样具有良好的降压效果，而且在肝气上逆型高血压的治疗中，也同样取得了较为满意疗效，其降压机制与活血化瘀、引血下行的功效密切相关[11-13]。川牛膝虽然降压效果明显，但是仍缺乏大量的随机样本实验，其降压作用机制仍有待阐释，同时关于川牛膝降压的具体有效成分还有待进一步的确认。网络药理学是医学、生物学、生物信息学等多学科基础理论与研究手段的整合，能系统、科学、综合地反映药物对疾病网络的干预机制。本文拟基于网络药理学和分子对接技术探讨川牛膝治疗高血压的物质基础与分子机制，借助网络药理学技术揭示川牛膝的主要有效成分以及治疗高血压疾病的潜在靶点和作用机制（见图1），为川牛膝的临床应用和深度开发提供研究基础，也为发现药物靶标、指导中药研发和发展中医药理论提供一定的科学依据。

图1 基于网络药理学和分子对接技术的川牛膝治疗高血压作用机制研究流程

资料与方法

1 川牛膝活性成分及相关靶点筛选

通过查阅Pubmed 上已发表相关文献结合中医药系统药理学平台TCMSP 确定中药川牛膝的组成成分，根据药物代谢动力学属性值口服利用度（OB）≥30%和类药性（DL）≥ 0.18 筛选活性成分[14]。根据每个活性成分可获得的对应靶点蛋白，通过UniProt 数据库（https：// www.uniprot.org）统一将化合物作用的蛋白质靶点进行信息规范转换。

2 高血压疾病相关靶点筛选

以“Hypertension”为关键词，通过在线数据库GeneCards（https：//www.genecards.org）、OMIM（http：//www.omim.org）挖掘与高血压治疗的潜在靶点，再进入DurgBank 数据库（https：//www.DurgBank.ca）寻找治疗高血压疾病的临床西药作用靶点进行补充[15]。合并3 个疾病数据库靶点后，删除重复值得到整合后的高血压疾病靶点蛋白。

3 川牛膝成分-高血压疾病靶点PPI 网络构建

为分析中药川牛膝相关靶点与高血压疾病靶点间的相互作用，将二者靶点基因取交集并绘制韦恩图。将交集共同靶点提交至String 数据库 （version 11.0，https：//string-db.org） 构建蛋白互作（PPI）网络[16]。生物种类为“Homo sapiens”，最小互相作用阈值“Highest confidence” 设置为（＞ 0.9）得到 PPI 网络，通过 CytoScape 3.7.2 中插件MCODE 对蛋白互作网络进一步分析，获得潜在的蛋白质功能模块，并通过分析其参与的生物学进程对其功能进行描述。运用Cytohubba 插件通过MCC 算法提取出前十关键基因并构建关键子网络。

4 川牛膝成分-高血压疾病靶点功能与通路的富集分析

Metascape 数 据 库（http：//metascape.org/gp/index.html）拥有全面的注释功能并且每月更新基因注释的数据资料[17]。将川牛膝治疗高血压相关靶点输入Metascape 平台，分析并富集其主要的生物学过程与代谢通路。

5 川牛膝成分-高血压疾病靶点-通路网络图的构建

运用CytoScape 3.7.2 构建川牛膝成分-高血压靶点-通路网络图。利用CytoScape 3.7.2 内置工具分析有效成分及靶点的网络拓扑参数，包括连接度（Degree）、紧密度（Closenesss）及介度（Betweenness）等，并根据网络拓扑学参数判断核心靶点及发挥药效的主要活性成分。

6 分子对接验证

分析得到川牛膝活性成分-高血压靶点网络图中度值排名前4 的核心靶点，查找其PDB ID，使用在线工具（CB-Dock Web Site）将4 个靶点与活性成分进行分子对接[17]，根据Docking Score 值评价靶点与活性化合物的结合强度与活性。

结 果

1 川牛膝活性成分靶点的获取

根据药物代谢动力学属性值属性值口服利用度（%）和类药性筛选到川牛膝主要活性成分4 个，分别是β 艾蒿素、红苋甾酮、β-谷甾醇和槲皮素，见表1。上述所有成分作用靶点共103 个，合并后删除重复值共得到靶点88 个。

表1 川牛膝主要的降血压活性成分

2 高血压疾病相关靶点的获取

分别从GeneCards、OMIM、DurgBank 数据库中挖掘治疗高血压潜在靶点8435 个、67 个和312 个，整合上述3 个疾病数据库靶点并删除重复值，共得到8476个高血压相关靶点。取活性成分靶点与疾病靶点基因交集并绘制韦恩图（见图2），对81 个交集靶点进行Uniprot 规范（见表2）。

表2 川牛膝活性成分与高血压疾病交集靶点基因

图2 川牛膝活性成分与高血压疾病靶点基因交集

3 川牛膝成分-高血压疾病靶点PPI 网络的构建

将交集靶点基因提交至 STRING 11.0 平台分析，将得到的数据通过Cytoscape 可视化分析得到靶点PPI 网络（见图3）。

图3 川牛膝活性成分与高血压疾病差异基因蛋白互作网络

PPI 网络中蛋白的作用是相互的。PPI 复杂网络中存在部分密度较高的区域称为 Community 或 Module，Module 网络是PPI 网络的潜在子网，其在区域部分连线少，连线密度较高，因此 Module 被认为是具有生物学意义的集合，该集合有2 种含义，一为蛋白质复合体，即多个蛋白质共同组成复合体而后发挥生物学作用；二为功能模块，如位于同一通路的蛋白质，其相互作用更加密切。为更精确地分析川牛膝治疗血脂异常的作用机制，运用 Cytoscape3.7.2 中的MCODE插件，通过分子复合物检测算法对相互作用关系进行分析，得到 Module（图4）。根据P 值，分别保留Module 中最佳评分的生物学进程对其进行功能描述（见表3）。并且运用Cytohubba 插件的MCC 算法提取出前十关键基因（见表4），构建关键子网络进行观察（见图5）。

表3 川牛膝与高血压疾病差异靶点PPI 提取模块功能描述

表4 采用Cytohubba 插件MCC 算法提取的Hub 前十靶点基因

图4 MCODE 提取川牛膝成分-高血压疾病靶点PPI 网络中的MCODE 得分

图5 使用Cytohubba 插件提取的Hub 前十靶点关键子网络

4 靶点功能与通路的富集分析

运用Metascape 平台对川牛膝治疗高血压进行功能与通路分析，由结果可见多个靶点的功能与高血压的调治关系密切，川牛膝治疗高血压主要参与的生物学过程见图6 A，包括细胞对激素刺激的反应（Cellular response to hormone stimulus）、细胞对有机环状化合物的反应（Cellular response to organic cyclic compound）、对类固醇激素的反应（Response to steroid hormone）、对有毒物质的反应（Response to toxic substance）、对异源生物刺激的反应（Response to xenobiotic stimulus）等，参与的通路见图6D，主要有Pathways in cancer、Hepatitis B、Fluid shear stress and atherosclerosis 等，前十通路富集结果见表5，相关靶点调节高血压的功能见图6B，主要富集于转录因子结合（Transcription factor binding）、近端启动子序列特异性DNA 结合（Proximal promoter sequence-specific DNA binding）等。

表5 川牛膝治疗高血压靶点top10 通路富集结果

图6 潜在靶点的GO 富集分析

5 川牛膝成分-高血压疾病靶点-通路网络图的构建

运用CytoScape 3.7.2 川牛膝成分-高血压疾病靶点-通路网络图，见图7。利用内置工具分析有效成分及靶点的网络拓扑参数，分析结果表明槲皮素连接度为70，介度为 0.66097，紧密度为0.70833。其次为β-谷甾醇（连接度为16，介度为0.10679，紧密度为0.40157）、β 艾蒿素（连接度为7，介度为0.00807，紧密度为0.35172）以及红苋甾酮（连接度为1，介度为0，紧密度为1.00000），见表6。预测槲皮素为川牛膝治疗高血压的核心活性成分。

表6 川牛膝主要活性成分网络节点特征参数

表7 根据Degree 值排名前十的关键基因

图7 川牛膝成分-高血压疾病与成分差异基因- 通路互作网络

6 分子对接验证

CB-Dock 在线工具对接是一种蛋白质-配体对接方法，可自动识别结合位点，计算中心和大小，根据查询配体自定义对接盒大小，然后与AutoDock Vina进行分子对接；CB-Dock 通过使用基于曲率的空腔检测方法预测目标蛋白的结合位点和使用AutoDock Vina 来查询配体的结合姿势，可以促进对接过程并提高准确性。Docking Score＞4.25 时表示活性成分与靶点间存在结合能力，＞5.0 时表示结合活性较佳，＞7.0 时表示结合活性极佳[17]。分子对接所得结果显示活性成分与靶点蛋白对接全部Docking Score ≥ 7（100%），最低为7.2，最高为9，说明川牛膝治疗高血压的四种活性成分β 艾蒿素、红苋甾酮、β-谷甾醇和槲皮素与 4 个靶点的结合活性较强。评分与分子对接结果分别见表8 和图8。

表8 川牛膝降血压活性成分与靶点蛋白的对接评分

讨 论

高血压是一种常见的、同时伴随着心脑血管病等发生的危险慢性疾病。中医辨证角度认为，肝阳上亢、肝肾阴虚、阴虚阳亢是高血压病的主要证候，在中医临床中多采用平肝潜阳、滋阴降火、祛痰化湿等治疗方法[20-21]。目前关于中医药治疗高压病的研究较多，中药降压不仅不良反应小，价格低廉，而且具有多成分、多靶点和多层次的作用特点。寻求有效的中医药治疗途径，对发挥中医药的整体调节优势有着十分重要的意义。川牛膝在多味用于治疗高血压疾病的中药中，如通过与其他中药进行配伍用于治疗高血压的一些常见证，如气虚、阴虚、肝风症以及阳亢症等使用的频率非常高且效果较好。故在中医临床上主要以川牛膝作为君药，根据患者的症状进行增减，用以改善患者的血流平衡、调整气血，进而对高血压进行治疗[22]。

本研究通过分子对接和网络分析构建复合目标网络。预测了川牛膝作为治疗高血压疾病活性成分出化合物为β 艾蒿素、红苋甾酮、β-谷甾醇和槲皮素，其中槲皮素为川牛膝降压的核心活性成分，阐明了川牛膝通过调节EGFR、ESR1、FOS、CCND1 等核心靶点干预高血压疾病的相互关系。有研究表明表皮生长因子受体（EGFR）参与原发性高血压[23]、肺动脉高压[24]的调节；雌激素受体（ESR1）与妊娠高血压密切联系[25]，在心血管疾病中起着重要的生理作用；核蛋白转录因子（FOS）参与高血压的调节，持续性高血压会诱导FOS 蛋白的表达增高[26]，而钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶可通过降低FOS 蛋白的表达来减弱高血压；细胞周期蛋白（CCND1）被证明参与了肺动脉高压的发病机制[27]，对抗CCND1 可以改善大鼠的肺血管重塑，说明其可能是治疗肺血管重塑和肺动脉高压的潜在靶点[28]，由以上可知筛选出的核心靶点基因与高血压疾病均具有一定的关联性。

KEGG 与GO 分析川牛膝治疗高血压的生物学通路主要集中于流体剪切应力与动脉粥样硬化通路和糖尿病并发症晚期糖基化终末产物及其受体信号通路等，其功能主要为通过质膜细胞粘附分子进行的嗜异性细胞间粘附等[29，30]。分子对接结果显示川牛膝的降血压活性成分与靶点的结合能力很强，分子对接评分均不小于7。基于生物信息学分析和计算机模拟技术，我们分析了川牛膝对高血压的活性物质和可能的分子机制，为后续实验研究提供了重要的理论基础。然而，本次网络药理学研究中的分子对接结果仅提供了化学物质与相应靶基因之间的不确定联系，与靶基因之间的精确作用模式如激活或抑制仍需要深入探讨。后续，应对筛选后的潜在有效化合物进行实验验证，以深入阐明基于理论预测的药物与蛋白质之间的相互作用。