屠金晶，张亮，陈益女，董肖琦，徐曙光，汤耀东

支气管扩张症典型的症状有慢性咳嗽、咳大量脓痰和反复咯血，可导致呼吸功能障碍及慢性肺源性心脏病[1]。在我国是一种非常普遍的慢性呼吸道疾病，但却远不及支气管哮喘和慢阻肺一样受到重视。广泛性支气管扩张可严重损害患者肺组织和功能、影响患者的生活质量，造成巨大的社会经济负担，是当前我国基层医院面临的严重挑战。

铜绿假单胞菌（PA）是导致支气管扩张症患者急性或慢性感染的主要病原体之一[2]。现有研究表明PA 感染与支气管扩张症的严重程度及病情进展密切相关。然而，针对支气管扩张症患者合并PA 感染的治疗研究非常有限。目前，多重耐药和广泛耐药PA的检出率呈逐年上升趋势，给临床治疗带来了严重威胁[3]。近年研究发现难治性PA 感染患者的校正死亡率高于碳青霉烯类耐药PA[4]。本研究分析2022年宁波市医疗中心李惠利医院分离的支气管扩张症患者PA 感染的分子流行病学特征，以期为PA 感染患者提供合理的抗菌药物使用依据。

1 资料与方法

1.1 菌株来源 纳入本院2022 年1—12 月临床分离的38 株PA，排除同一患者重复菌株。质控菌株为铜绿假单胞菌ATCC27853。

1.2 PA 的菌种鉴定 将上述临床分离菌株接种于MHA 培养基，37 ℃过夜培养。挑取单菌落涂布于MSP 96 target polished steel BC 板的靶点上，涂布应轻薄均匀。吸取1l 基质溶液分别加至各个靶点，应注意各个靶点溶液不要相连，室温下自然晾干。将BC 板放入基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪（MALDI-TOF MS）中，运行程序并记录结果。

1.3 药敏实验 使用琼脂稀释法测定11 种抗菌药物的最低抑菌浓度（MIC），包括哌拉西林/他唑巴坦、头孢他啶、头胞吡肟、氨曲南、亚胺培南、美罗培南、庆大霉素、阿米卡星、妥布霉素、环丙沙星和磷霉素。多黏菌素B 使用肉汤稀释法测定MIC。折点解读参考美国CLSI 标准[5]。当头孢他啶≥32 mg/L、氨曲南≥32 g/L、哌拉西林/他唑巴坦≥128/4 mg/L、碳青霉烯类（亚胺培南或美罗培南）≥8 mg/L 和环丙沙星≥2 mg/L 时定义为难治性PA[4]。

1.4 全基因组测序及生信分析 采用第二代测序技术的建库测序，经电泳检测合格的DNA 样品用Covaris 超声波破碎仪随机打断成长度约为350 bp 的片段。处理完成后的DNA 片段，使用NEBNext®Ultra™DNA Library Prep Kit for Illumina（NEB，USA）试剂盒，经末端修复、加A 尾、加测序接头、纯化、PCR 扩增等步骤完成整个文库制备。文库构建完成后，先使用Qubit 2.0 进行初步定量，稀释文库至2 ng/l，随后使用Agilent 2100 对文库的插入片段进行检测，insert size 符合预期后，使用Q-PCR 方法对文库的有效浓度进行准确定量，最后进行PE150的上机测序，数据量1G，实现平均测序深度100×以上。38 株菌使用Illumina Nova-seq 6000 平台（诺禾致源生物信息科技有限公司，中国北京）进行全基因组测序。耐药基因和多位点序列分型（MLST）使用ResFinder v3.0 在线比对（http://www.genomicepidemiology.org）。

2 结果

2.1 纳入患者基本信息 38 例中，男27 例，女11例；年龄为（69.0±14.0）岁。分别来源于ICU（13 株）、呼吸内科（10 株）、神经外科（10 株）、感染病科（2例）、肝胆胰外科（2 例）和胃肠外科（1 例）。

2.2 药敏结果 38 株PA中对阿米卡星和妥布霉素敏感率为97.4%，所有菌株对多黏菌素B敏感，亚胺培南和美罗培南的耐药率分别为84.2%和57.9%。38 株PA 中有17 株为难治性PA，见表1。

表1 12 种抗菌药物的药敏结果

2.3 MLST分型及耐药基因分析 38 株PA中主要的ST 型为ST277（7/38，18.4%）、ST 1076（5/38，13.2%）和ST 3012（5/38、13.2%）（图1）。所有ST1076、ST1623 和ST3012 菌株均为难治性PA。此外，所有分离菌株中均检测到耐药基因blaPAO、aph（3’）-IIb 和catB7。12 株（31.8%）携带aph（3’）-IIb基因的菌株仍对庆大霉素敏感。值得注意的是5 株ST 1076 均携带blaOXA-395和blaKPC-3，从而介导泛耐药。

图1 38 株铜绿假单胞菌的MLST 分型分析

3 讨论

目前我国没有支气管扩张患病率的流行病学详细资料，但随着胸部高分辨率CT等检查手段大范围开展，支气管扩张症其实并非少见病。研究显示，临床诊断为慢性支气管炎或慢性阻塞性肺病的患者中，15%～30%的患者可发现支气管扩张，重度慢性阻塞性肺病患者合并支气管扩张的甚至可达50%[5-6]。PA是支气管扩张症中检出率最高的致病菌检出率为18.5%～73.5%,也是我国支气管扩张症急性加重期检出率最高的病原菌[7-8]。现有研究认为细菌定植、炎症刺激和肺组织破坏是支气管扩张的重要发病机制[9-11]。多项研究显示，慢性呼吸道感染可导致支气管扩张患者频繁急性加重及生活质量下降[12-14]，PA定植也是引起成人支气管扩张症的重要危险因素。研究显示，PA感染是支气管扩张患者急性加重的重要危险因素，根除PA 可以改善患者的预后[15-17]。

Shortridge 等[3]研究指出血流感染中难治性PA的感染率为2.3%。本研究中，有44.7%（17/38）的分离菌株为难治性PA，比文献报道的高，可能和本研究所有分离菌株来自痰液有关。Shortridge 等[3]证实肺部感染患者（27.7%）中多重耐药PA的分离率高于血流感染（23.7%），但庆幸的是97.4%的PA 对阿米卡星和妥布霉素敏感，且所有菌株对多黏菌素B 敏感，从而避免了无药可选的困境。

支气管扩张患者的预后还跟其感染的PA 耐药性和毒力机制有重要关联。为了使初始抗菌药物能覆盖可能的病原菌，尤其是耐药PA，临床可能会增加应用广谱抗菌药物或者联合应用抗菌药物的频率，导致多重耐药菌（MDRO）的出现[18-19]。碳青霉烯类抗生素是治疗PA感染的关键药物，但由于此类药物的不合理使用，导致近年临床上出现越来越多的耐碳青霉烯铜绿假单胞菌（CRPA），对支气管扩张患者的治疗提出重大挑战。从全球来看，PA 对碳青霉烯类抗生素的耐药情况差异较大。美国耐药监测表明，2005—2014 年PA 对碳青霉烯类抗生素的耐药率平均为8.71%[20]；2004—2014 年拉丁美洲耐药率也高达66%；欧洲地区的平均耐药率则在14.5%以上；2010 年亚太地区PA 对美罗培南和亚胺培南的耐药率分别是21.6%和27.7%[21]；我国耐药监测系统显示，2015 年PA 对碳青霉烯类抗生素的平均耐药率为22.4%，其中最低地区的耐药率广西壮族自治区为12.6%，而最高地区北京市的耐药率32.7%。2013 年CHINET 细菌耐药监测表明PA 对美罗培南和亚胺培南的耐药率分别为25.1%和27.1%。本文在相关支气管扩张患者中均检测到了CRPA，突显了本院支气管扩张患者已面临CRPA 的威胁。

现有PA 的耐药机制包括外排泵、生物膜形成、抗菌药物灭活酶、靶突变和通过水平基因转移获得耐药基因[8-9]。本研究中，所有分离株均携带blaPAO、aph（3’）-IIb 和catB7，这3 个耐药基因也常见于碳青霉烯类耐药铜绿假单胞菌[10]。aph（3’）-IIb 基因表达产物是一种与氨基糖苷类抗菌药物有交叉反应性的代谢酶[11]，然而12 株携带aph（3’）-IIb基因的菌株对庆大霉素敏感，提示可能存在其他调控机制介导氨基糖胺类耐药的发生。前期有研究指出铜绿假单胞菌存在克隆传播，特别是ST175、ST235 和ST111可介导多重耐药流行，且患者预后更差[12]。本研究中有5 株ST1076 均携带blaOXA-395和blaKPC-3，且分布在ICU 和神经外科。通常blaKPC-3基因常位于质粒上，推测ST1076 型菌株可能更容易捕获携带blaKPC-3基因的质粒。

本研究仍有一定的局限性。首先样本的数量有限，未进一步针对难治性PA 进行分层研究。其次未进行菌株毒力相关研究。未来需要进一步针对不同感染部位和耐药机制的难治性PA 进行深入研究。

综上所述，本院支气管扩张症患者合并PA感染呈散发流行，但难治性PA 的分离率较高，其中ST1076 需要引起临床重视，加强监测，并采取有效措施防止该类菌的感染及传播。

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