汤佳立 童玥

1 中国药科大学生物制药实验教学中心 南京 211198 2 中国药科大学生命科学与技术学院 南京 211198

0 引言

郭沫若说过：“教学的目的是培养学生自己学习，自己研究，用自己的头脑来想，用自己的眼睛去看，用自己的手来做这种精神。”培养具有独立实践能力、学习主动性和创新能力的技术型人才是党和人民赋予高校的历史使命，具有创新意识的实验室是培养大学生创新意识和创新能力的重要平台。只有努力创造条件，给学生更多进入实验室的机会，才能激发学生在实践中参与创新的积极性，从而充分发挥实验教学在本科生素质教育和创新能力培养中的作用。为此，围绕培养和提高大学生创新意识和能力，各地高校从实验室资源建设和运行机制等方面进行了大量有益的探索和实践，并取得了一些经验[1-2]。

从2006 年开始，笔者所在高校尝试建立符合本校实际情况的开放式实验教学模式，采取实验项目开放、实验室开放等多种形式[3]。开放实验项目一般是在每个学期初由教师申报课题，学生和教师双向选择，学生主要利用课余时间完成指定的实验内容，实验开展期间指导教师需在实验室准备和维护实验仪器设备，进行现场管理指导，项目持续至该学期结束，最后由指导教师对学生实验完成情况作出评价。经过十多年的实践，整体效果较好，不仅调动了广大学生参与实验的积极性和主动性，而且还激发了学生敢于探索、勇于创新的想象力和创造力。但从学生和教师的反馈来看在实验内容和开放方式等方面还可以进一步完善。

近20 多年来，现代生物技术发展迅速。60%以上的生物技术成果应用于医药行业，生物制药产业也在崛起。传统医学得到了改进，特色新药得到了开发[4]。与此同时，对生物制药专业人才的需求也在逐年增加。这就对高校培养具有独立思考和解决问题能力、实践和创新能力的生物制药人才提出了更高的要求。

笔者负责生物制药实验中心的实验教学辅助工作。实验室面向生物制药专业、生物技术专业等开设生物制药综合、生物制药工艺学、生物技术等实验课程。在平时与学生的交流过程中发现，学生对于开放实验有较高的热情，希望在选题方面有更多的选择、有更多的参与自主设计的机会。为此笔者和教研室教师一起设计了“硫酸软骨素的提取和分析鉴定”的综合性实验作为开放实验，并添加了翻转课堂的理念。该实验综合了多糖的制备、含量测定、琼脂糖电泳鉴定等生物制药行业的基础操作技能，适合本科生完成，融入翻转课堂的形式后学生自主参与度更高，有利于培养学生的创新思维，提高学生自主学习和科研创新能力[5]。

1 实验设计背景及意义

硫酸软骨素（Chondroitin Sulfate，CS）是以蛋白聚糖的形式广泛分布于动物的软骨、肌腱、韧带和血管壁等组织中的一种酸性粘多糖[6-7]。硫酸软骨素作为一种天然产物，具有增强免疫力、抗关节炎、调节血管生成、降血脂、抗病毒、抗凝、抗肿瘤等多种生物活性[8-10]，还具有保水性、保胶性和高黏性[11]，已经被广泛应用于医药、功能性食品、化妆品添加剂等领域，具有良好的市场前景。硫酸软骨素的提取方法主要有：浓碱提取、稀碱浓盐提取、酶提取法及超声波法等。不同的原料，适用的提取方法也会有所差异。

2 将翻转课堂融入开放实验教学

近年来，翻转课堂在理论课教学中逐渐成为一种热门的教学方式，很好地突出了以学生为中心的理念。传统的教学模式是由教师的课堂讲解为主，学生被动接受，而翻转课堂则是学生课前自主学习，课堂上师生深度互动，从而提高学生的学习效率[12]。

将翻转课堂的形式融入开放实验项目，可以更好地发挥学生的主观能动性。具体实施方案是：教师先拟定课题，课题不宜太复杂，选择两位以上不同专业或不同年级的学生，以便学生之间协调时间，保证实验持续进行。建立开放实验的QQ 讨论群或者微信群，让学生查找实验相关文献资料、视频或者多媒体资源等共享在群内，学生通过该预习过程可以对将要开展的实验有所了解。然后由学生根据实际的实验材料和本实验室情况拟定实验方案。随后组织学生现场讨论，教师进行必要的讲解和答疑，最终形成较为完善的实验方案，并安排实验日程，对于某些不清楚的操作细节可以由教师针对性地回答与补充，不会操作的仪器设备由教师现场指导。

3 开放实验的设计

3.1 实验材料与仪器

实验材料：新鲜牛软骨，胰蛋白酶，D-葡萄糖醛酸，四硼酸钠，咔唑，巴比妥钠，甲苯胺蓝，琼脂糖，NaOH，盐酸，浓硫酸，无水乙醇，溴酚蓝。

仪器：电子天平，离心机，组织捣碎机，紫外分光光度计，水浴锅，电热鼓风干燥箱，电泳仪，电泳槽。

3.2 实验实施过程

3.2.1 硫酸软骨素的提取

取新鲜牛软骨，在80 ℃热水中洗涤，用刀刮除骨表面的结缔组织等杂质，清洗干净，用组织捣碎机打碎，称取10 g，加入30 mL（三倍骨重量）的1 mol/L NaOH，40 ℃碱提2 小时，随后用4 mol/L盐酸调节pH 至7.0，双层滤布过滤，收集滤液，用4 mol/L NaOH 调节pH 至8.5 ～9.0，加入1‰滤液量的胰蛋白酶，40 ℃水解2 h（水解过程中应不断调节溶液pH 至8.5 ～9.0），水解液80 ℃加热30 min，4 mol/L 盐酸调pH 至3.0，静置2 h，4 000 rpm，5 min 离心收集上清，用4 mol/L NaOH调pH 至6.5，缓慢搅拌加入两倍体积无水乙醇，静置2 h，4 000 rpm，5 min 离心收集沉淀，无水乙醇脱水，再次4 000 rpm，5 min 离心，去除上清，刮取沉淀于干燥器中常温干燥，得到硫酸软骨素粗品0.13 g。

3.2.2 含量测定及得率计算

1）试剂配制。

D-葡萄糖醛酸标准溶液：0.0200 g D-葡萄糖醛酸标准品用去离子水定容至100 mL。

硼砂—硫酸试剂：四硼酸钠4.7671 g 用浓硫酸定容至500 mL。

咔唑试剂：0.125 g 咔唑用无水乙醇定容至100 mL，低温保存。

2）实验步骤。

称取硫酸软骨素粗品0.1 g，用1.0 mL 去离子水溶解，再分别稀释200 倍和300 倍后，采用硫酸咔唑法，于530 nm 波长处测其吸光值。

分别取D-葡萄糖醛酸标准溶液1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL 用去离子水定容至10 mL，得到浓度分别为20 μg/mL、40 μg/mL、60 μg/mL、80 μg/mL、100 μg/mL、120 μg/mL 的 D-葡萄糖醛酸标准溶液。将各装有5 mL 硼砂—硫酸试剂的7 支试管，在冰浴条件下分别加入1.0 mL不同浓度的D-葡萄糖醛酸标准溶液，用去离子水做空白对照，注意避免出现沸腾。沸水浴10 min 后迅速冷却至室温，分别加入咔唑试剂0.2 mL，沸水浴15 min 后冷却至室温。530 nm 测定吸收值。根据吸光值（A）和 D-葡萄糖醛酸浓度（C）绘制其标准曲线。

根据标准曲线方程（A 为吸光值，C 为葡萄糖醛酸含量，检测范围为0 ～120 μg/mL），计算提取物中葡萄糖醛酸含量:

葡萄糖醛酸含量（%）=（m1/0.1）×100

式中，m1为0.10 g提取物中葡萄糖醛酸含量（g）。已知硫酸软骨素中氨基己糖的含量为37.00%（w/w），而氨基己糖与葡萄糖醛酸的质量比为0.82 ∶1（w/w），因此硫酸软骨素中葡萄糖醛酸含量为45.12%（w/w），据此可以计算出提取物中硫酸软骨素的得率：

硫酸软骨素得率（%）=（m1/45.12%/m2）×100

式中m1为提取物中葡萄糖醛酸含量（g），m2为牛软骨质量（g）。

3.2.3 琼脂糖电泳鉴定

1）试剂配制。

电极缓冲液（0.06 mol/L 巴比妥钠溶液）：取巴比妥钠12.4 g 溶于800 ml 水中，用2 mol/L HCl调pH 值至8.2，加水定容至1 000 ml。

甲苯胺蓝染色液：取甲苯胺蓝0.2 g，加入少量乙醇，于60 ℃水浴加热，待颗粒全部溶解后加水定容至200 ml，滤纸过滤备用。

2）琼脂糖电泳。精确称取8.0 mg 标准品，用1 ml 双蒸水溶解，配制成8 mg/ml 的溶液。各吸取50 μl 分别与溴酚蓝溶液1 ∶1 混合均匀，放入4 ℃的冰箱待用。

将测定含量用0.1 g/mL 的样品溶液用双蒸水稀释1 倍，配成0.05 g/mL 的溶液。各吸取50 μl分别与溴酚蓝溶液1 ∶1 混合均匀，放入4 ℃的冰箱待用。

称取琼脂糖0.5 g，加热溶于50 ml 电极缓冲液中，冷却至60 ℃左右。制成厚度约为3 mm 的胶板（7 cm×9 cm）。设0.05 g/mL、0.1 g/mL 两个样品浓度，5 μl、10 μl 两种上样量进行比较，于负极端点样后置电泳槽中；加入电极缓冲液，在100 V电压下进行电泳。观察指示剂的移动情况，待指示剂行至距凝胶前沿约2 cm 处，停止电泳。剥取凝胶，用甲苯铵蓝染色液染色10 min，用水脱色过夜，观察结果。

4 结果与讨论

4.1 含量测定及得率计算结果

标准曲线如图1 所示。

图1 葡萄糖醛酸标准曲线

样品测定结果如表1 所示。

表1 葡萄糖醛酸含量

选取样品稀释300 倍后的测定结果进行计算：

葡萄糖醛酸含量（%）=（m1/0.1）×100

式中m1为0.10 g提取物中葡萄糖醛酸含量（g）。

葡萄糖醛=84.33×300/106/0.1×100=25.30%

硫酸软骨素得率（%）=（m1/45.12%/m2）×100

式中m1为提取物中葡萄糖醛酸含量（g），m2为牛鼻软骨质量（g）。

得率（%）=（0.13g×25.30%/45.12%/10）×100=0.73%

4.2 琼脂糖电泳结果

设置0.05 g/mL、0.1 g/mL 两个样品浓度5 μl、10 μl两种上样量进行琼脂糖电泳结果如图2所示。

图2 琼脂糖电泳结果

1）0.05 g/mL 上样10 μl；2）0.05 g/mL 上样5 μl；3）0.1 g/mL 上样10 μl；4）0.1 g/mL 上样5 μl；5）标准品上样5 μl 与标准品比对，电泳条带位置完全一致，且浓度较高，在以后的实验中样品可以选用0.05 g/mL 的浓度，5 μl 上样量进行电泳。

5 结束语

本次开放实验的设计，引入了翻转课堂的形式，充分体现了以学生为主体的教学理念，增强了学生参与实验的主动性和积极性，通过实验学生很好地掌握了硫酸软骨素的提取、含量测定、得率计算、琼脂糖电泳鉴定等实验及分析方法。在实验开展前，学生通过独立查阅大量的文献，学习视频资料、多媒体材料，对硫酸软骨素研究背景和目前的研究进展有了初步的了解，初步制定了实验流程，经过师生的讨论，最终形成完善的方案，该过程能够让学生体会到实验的完整性和严肃性；在整个实验过程中，学生之间、师生之间在遇到问题时能通过多种途径进行积极的讨论，活跃了学生的思维，训练了他们独立分析问题和解决问题的能力；实验结束后，每位学生都要撰写实验论文，对实验结果进行分析。整个流程下来，培养了学生查阅资料、设计实验、团队合作、论文写作等多方面的能力，训练了学生严谨的科学思维，激发了学生参与创新的热情，也为学生后期的就业、深造奠定了基础。