纪海茹, 孔令伟, 曹胜

(1.承德医学院 病理学教研室, 承德 067000; 2.承德医学院附属医院 创伤骨科, 承德 067020)

作为一种原发性恶性骨肿瘤, 骨肉瘤常发于儿童和青少年, 预后较差[1]。以手术和辅助化疗为主的标准治疗虽已显著提高了骨肉瘤患者的总体生存率, 但在治疗患者中仍会有约30%由于肿瘤细胞的转移而导致病情恶化[2-4]。因此, 为更好地治疗疾病, 深入研究骨肉瘤发病的分子机制和探索新的治疗方法及生物标志物显得尤为重要。组织蛋白酶D(cathepsin D, Cat D)是在粗面内质网腔体内合成的一种溶酶体内天冬氨酸内肽酶, 主要作用是消化溶酶体内细胞残留和蛋白多肽, 进而维持细胞健康[5-7]。研究发现, Cat D在细胞外环境中可对乳腺癌[8]和胰腺癌[9]等肿瘤的生长产生明显的促进作用。此外, Cat D在骨肉瘤患者中高表达且Cat D高表达组骨肉瘤患者的生存期较Cat D低表达组显著缩短(χ2= 6.42,P<0.025)[10]。然而, Cat D分子在骨肉瘤中的具体作用和潜在调控机制仍较少有研究且结论尚未统一。因此, 本研究通过小发夹RNA(short hairpin RNA, shRNA)特异性下调骨肉瘤细胞中CatD的表达, 旨在探讨Cat D对骨肉瘤细胞增殖、侵袭和凋亡的影响及其可能分子机制。

1 材料与方法

1.2 实验方法

1.2.1 细胞的培养冻存的hFOB、Saos-2、MG63和U2OS细胞复苏后于5% CO2、37 ℃、相对湿度95%细胞培养箱中用含10% FBS的DMEM培养液培养。待细胞融合度超过90%时传代培养, 于对数生长期收集细胞用于后续实验研究。

1.2.2 细胞的转染选择Cat D表达水平较高的MG63和U2OS细胞作为实验对象。将对数生长期的MG63和U2OS细胞按2×105个/孔密度接种于6孔板中, 按照实验要求将细胞分为sh-NC组(阴性对照组)、sh-CatD组(CatD沉默组)、sh-CatD+Wortmannin组(Wortmannin干预组)和sh-CatD+740Y-P组(740Y-P干预组)。Wortmannin干预组和740Y-P干预组细胞分别用10 μmol/L Wortmannin或740Y-P各200 μL干预处理24 h。待各组培养细胞融合度达80%时, 通过LipofectamineTM2000阳离子脂质体将shRNA-CatD及其阴性对照shRNA-NC质粒分别转入sh-CatD组和sh-NC组细胞。……