沈麒亮，方志娟，李晓芹，张雪婧，王伟

苏州市食品检验检测中心（苏州 215104）

食品掺假作为一种食品欺诈的行为，是影响食品安全的一个重要方面[1-2]。如今猪肉冒充牛肉等现象越来越多，市民对肉类掺假的问题也越来越重视[3-4]。不同肉类具有不同的营养价值和口感，各种肉类之间也存在一定价格差异，肉类掺假往往是商家为谋取更多的利益的一种手段。因此，旨在提出准确有效的方法加强对肉类的掺假鉴别，以维护良好的市场环境[5-7]。

近年来，越来越多的方法被应用于肉类掺假检测，如聚合酶链式反应[8-9]、近红外光谱[10-12]、酶联免疫分析法[13]、核磁共振技术[14-15]、电子鼻结合统计学分析技术[16-18]等。这些方法虽然准确可靠，但同时也存在着操作复杂、时间过长、费用昂贵等缺点。基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）作为一门新兴技术，适用于测定蛋白质、多肽、脂质等大分子[19-21]。因其前处理简单、检测范围广等优点，近年来被广泛应用于微生物、乳制品、水产品、食用油、蜂蜜等各领域[22-27]。试验采用MALDI-TOF MS技术构建出不同畜肉蛋白质分子指纹图谱标准数据库，可对猪、牛、羊3种不同畜肉进行高效鉴别。此次建立的猪、牛、羊源性成分鉴定系统，具有快速、准确、低成本、重复性好的优势，可被广泛应用于肉类掺假检测。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

SA IV型蛋白、多肽提取或纯化试剂[融智生物科技（青岛）有限公司]；磷酸盐缓冲液（PBS）。

畜肉样品（54批次猪、46批次牛、50批次羊，均购自当地超市）

1.2 仪器与设备

QUANTOF 1质谱仪[融智生物科技（青岛）有限公司]；AL204电子天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]；BagMixer 400拍打式均质器（法国Interscience公司）；IQ7000超纯水机[密理博（中国）有限公司]。

1.3 试验方法

1.3.1 畜肉样品蛋白质的提取

称取25 g样品（分别为猪肉、牛肉、羊肉），用水清洗后放入无菌袋中，倒入225 mL磷酸盐缓冲液（PBS）；在拍打式均质器上以4次/s的速度，均质2 min；将上清倒入50 mL离心管中，于4 ℃冰箱，静置8 h。从50 mL离心管中取上清，即得肉浸液，可放入-80 ℃冰箱备用。取2 μL肉浸液，加18 μL SA IV型蛋白、多肽提取或纯化试剂，混匀，滴加2 μL于靶点正中，干燥，待上机检测。

1.3.2 质谱数据的采集

将制备好的样品靶通过检测口放入质谱仪内部托盘并固定。启动激光系统提供脉冲激光，打击样品靶点，在质荷比2 000～35 000范围内扫描和采集数据。采用仪器自带分析软件对质谱图进行平滑、对齐、归一化等处理。

1.3.3 化学计量学分析

将采集到的150组MALDI-TOFMS数据导入Chem Pattern化学计量学软件[科迈恩（北京）科技有限公司]，筛选获得共有模式，对猪、牛、羊3种畜肉的差异性进行多元统计分析。

2 结果与分析

2.1 猪、牛、羊动物源性成分指纹图谱的建立

对150批次3种不同类型的畜肉进行测定，采集MALDI-TOF MS谱图并进行平滑、对齐、归一化等处理，猪、牛、羊3种不同类型畜肉质谱图如图1所示。

图1 3种不同类型畜肉质谱图

2.2 指纹图谱相似度分析

将质谱数据导入Chem Pattern软件进行分析，样品图谱经去背景、平滑等规范化前处理，以保留时间对样品图谱进行校正。采用欧氏距离算法分析相似度，可以看出猪、牛、羊3种不同类型畜肉能够归属到各自类别，同一类型产品距离共有模式的距离相当，分离效果较好（图2）。

图2 相似度评价结果

2.3 指纹图谱多元统计分析

多元统计分析方法常用的有系统聚类分析、主成分分析、偏最小二乘判别分析、自组织映射人工神经网络等[28]。系统聚类分析是将一些相似度较高的样品先聚合为一类，根据相似程度将不同类的样品不断聚合成一个更大的类，直到所有的样品都聚合完毕，从而形成一张完整的系统聚类图，能准确反映各类之间的亲疏关系[29]。主成分分析是依据降维思想，损失较少原始信息，直接把多个指标转化为几个综合指标的一种多元统计方法[30]。偏最小二乘判别分析是偏最小二乘回归的一种特殊形式，是对多元线性回归模型的拓展分析。自组织映射人工神经网络适用于复杂体系数据的可视化、降维、模式识别以及数据挖掘，它能够将任意维数的原始数据在保持拓扑结构不变的情况下映射到二维空间内。

猪、牛、羊3种不同类型畜肉的系统聚类分析如图3所示。按照不同对象之间差异，利用欧式距离函数作模式进行分类，图3（B）中的颜色代表归一化法下各个峰所占的面积百分比。系统聚类分析结果显示，3种不同类型畜肉都能被很好地区分开。该分析方法可直观观察每个样品中的共有峰在样本和自变量2个维度中所形成的聚类模式及其对聚类结果的影响，能够清楚地反映样本之间的亲疏关系。

图3 聚类分析结果

主成分分析及偏最小二乘回归分析如图4和图5所示。3种不同类型畜肉能很好地被分开，很少有样品出现偏离现象，2种不同的分析方法结果完全相同。图6自组织映射神经网络分析显示的样品位置情况更为直观，样品分类结果与图4、图5这2种分析方法结果完全一致。

图4 主成分分析图谱

图5 偏最小二乘回归分析图谱

图6 自组织映射神经网络图谱

2.4 化学模式识别

将9批次牛肉样品作为测试集，采用PLS-DA算法进行模式识别，测试结果如表1和图7所示。可以看出，牛肉样品全部被正确识别，误识率为0，识别率为100%。因此，所建立的模型能够提供一个稳定的评价标准，准确判定所选畜肉的类型。

表1 模式识别结果统计

图7 PLS-DA模型分类预测效果图

3 结论

利用MALDI-TOF MS技术分析猪、牛、羊3种不同畜肉的蛋白质谱图，建立不同畜肉蛋白质分子指纹图谱标准数据库。配合Chem Pattern先进化学计量学分析，建立基于蛋白质组学的成分鉴定系统，为猪、牛、羊3种不同畜肉动物源性成分的鉴别提供新思路。