许晨新，张景正，严宝飞，张思访，刘 嘉

江苏卫生健康职业学院 药学院，江苏 南京 211800

我国是茶叶生产、加工和消费大国，茶叶资源种类丰富，是我国特色地理标志性产品[1]。唐代《茶经》中记载茶叶有助于睡眠、促进消化、利尿排毒等功效。现代研究亦表明茶叶富含多种营养物质，如茶多酚、氨基酸、生物碱、微量元素和糖类等成分[2]，具有抗氧化、抗肿瘤、降血压、调血脂、杀菌消炎等药理作用[3-9]。茶叶中的主要活性成分含量因产地不同而略有差异，其有效物质的种类和含量成为评价茶叶品质的重要依据[10]。雨花茶是我国十大名茶之一，是江苏省优质名茶代表，2005年获批国家地理标志保护产品[11-12]。雨花茶属于绿茶，作为未发酵茶，保留了许多天然成分，其茶多酚含量高于其他茶类[13]。

茶多酚是茶叶中的活性成分，主要由多羟基酚类化合物构成，是茶叶中多酚类物质的总称[14-15]。茶多酚主要包括儿茶素类、黄酮类、黄酮醇类和花色苷类等多酚物质，约占茶叶干重的20%～35%[16]，其中儿茶素类约占60%～80%[17]，主要由没食子酸、儿茶素、表儿茶素、咖啡因、表没食子儿茶素等组成[18]。目前，茶多酚已广泛应用于食品、医药、保健品和化妆品等领域[19]。有关茶多酚抗肿瘤机制研究多集中在其单体中，不能整体体现茶多酚的多成分、多靶点和多通路抗肿瘤的机制。

近年来，指纹图谱技术已广泛应用于食品和药用植物领域，其可以直观反映食品和药物的质量标示成分并用于品质控制和鉴别[20]。网络药理学作为探索中药作用机制及活性成分开发的一种有力工具，其通过“药物-靶点-疾病”的网络图，一方面可以有效揭示多分子协同机制，另一方面可以预测中药成分分子的潜在作用机制，从而进一步寻求新药物[21]。本研究拟采用HPLC分析方法，建立雨花茶的HPLC指纹图谱及其含量测定方法。在此基础上，结合网络药理学研究方法构建雨花茶“主要成分-核心靶点-主要通路”的网络图，以期为雨花茶抗肿瘤机制的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

雨花茶样品购于南京及周边地区，来源信息详见表1，茶品均置于冰箱冷藏保存。

表1 雨花茶信息Table 1 Origin of Yuhua tea product

1.2 仪器与试剂

1.2.1 主要试剂

色谱级乙腈购于Merck公司，分析纯甲酸购于上海凌峰化学试剂有限公司，分析纯乙醇购于上海久亿化学试剂有限公司；对照品没食子酸（批号：RP191126）、表没食子儿茶素（批号：RP210614）、儿茶素（批号：RP210819）、咖啡碱（批号：RP201026）、表儿茶素（批号：RP190620）、表没食子儿茶素没食子酸酯（批号：RP210806）、表儿茶素没食子酸酯（批号：RP210727）均购于成都麦德生科技有限公司；对照品质量分数均大于98%。

1.2.2 仪器设备

安捷伦1260 Infinity高效液相色谱仪：配有G1311C型四元梯度泵、G1329B型自动进样器、G1316A型柱温箱、G4212B型DAD检测器及ChemStation工作站（美国安捷伦公司）；X105BDU型十万分之一电子分析天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；Heraeus Fresco 21型高速冷冻离心机（赛默飞科技有限公司）；KH5200B型超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）；Milli-Q实验室纯水仪（德国Milli-Q达姆施塔特默克集团）。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件

Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相：0.1%甲酸水（A），乙腈（B）；梯度洗脱（0～5 min，5% B；5～35 min，5%～12% B；35～50 min，12%～16% B；50～60 min，16%～80% B；60～70 min，80%～5% B）；进样量为5 μL；柱温为30℃；流速为1.0 mL/min。

1.3.2 对照品溶液的制备

分别精密称取没食子酸、表没食子儿茶素、儿茶素、咖啡碱、表儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯、表儿茶素没食子酸酯对照品适量，加甲醇配制成浓度分别为1.03 mg/mL、2.28 mg/mL、2.12 mg/mL、1.62 mg/mL、2.11 mg/mL、2.84 mg/mL、2.03 mg/mL的对照品贮备液。临用时稀释成系列浓度的对照品工作液。

1.3.3 供试品溶液的制备

取各批次雨花茶样品0.50 g，加15 mL浓度为55%的乙醇，称定质量，超声提取90 min，取出放冷补足失重，经0.45 μm滤膜过滤即得供试品溶液。

1.3.4 含量测定

（1）专属性考察。分别取混合对照品溶液和供试品溶液进行进样分析，考察样品各组分的分离度。

（2）线性关系考察。取对照品溶液稀释成系列浓度的对照品工作液进样测定并记录峰面积。以浓度为横坐标（X，μg）、峰面积为纵坐标（Y）绘制标准曲线，进行回归分析。

（3）精密度实验。取同一对照品溶液连续进样6次，以咖啡碱为参照峰，测定各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD值。

（4）稳定性实验。取S1供试品溶液，分别在0 h、4 h、8 h、16 h、24 h、32 h、48 h连续进样测定，以咖啡碱为参照峰，计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD值。

（5）重复性实验。取6份S1供试品溶液分别进样测定，以咖啡碱为参照峰，计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD值。

（6）加样回收率实验。分别称取已知含量的6份样品，每份0.1 g，加适量对照品溶液进样测定，计算各成分的含量及平均加样回收率。

1.3.5 指纹图谱构建及相似度评价

按照“1.3.3”方法制备S1～S12供试品溶液，将12批雨花茶样品的AIA数据采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）”进行分析，建立其指纹图谱并进行相似度评价。

1.3.6 雨花茶网络药理学分析

（1）主要成分及其靶点的筛选。根据雨花茶的指纹图谱特征峰与定量成分，基于TCMSP、Swiss Target Prediction、PubChem、UNIPROT数据库获取其活性成分信息并对其成分的靶点信息去重，基于Gene cards、OMIM数据库检索肿瘤相关靶点将药物靶点和疾病靶点取交集得到共有靶点。

（2）成分-靶点网络图构建。将成分和靶点信息导入Cytoscape 3.9.0软件，构建“成分-靶点”可视化网络图。

（3）PPI网络构建及核心靶点的筛选。将交集靶点导入String数据库，选择物种为“人类”，设置最低要求互作分数为0.9，构建蛋白互作关系，得出核心靶点。

（4）GO生物过程富集分析。通过DAVID数据库，选择人类基因对交集靶点对应的基因进行GO分析（p＜ 0.05）。

（5）KEGG信号通路富集分析。通过DAVID数据库，选择人类基因对交集靶点对应的基因进行KEGG生物富集分析（p＜ 0.05）。

（6）成分-靶点-通路的可视化网络构建。将成分和靶点以及前10条通路的相关信息导入Cytoscape 3.9.0软件，构建雨花茶的“成分-靶点-通路-疾病”的网络关系图。

2 结果与分析

2.1 方法学考察结果

2.1.1 系统适应性

混合对照品溶液和供试品溶液色谱图见图1。各组分分离度均大于1.5，表明该方法的系统适应性和专属性良好。

图1 样品（A）和对照品（B）色谱图Figure 1 Chromatogram of sample（A）and standard（B）

2.1.2 线性关系

以浓度为横坐标（X，μg），峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线。线性回归方程见表2。线性关系良好。

表2 雨花茶中7个成分的线性关系考察结果Table 2 Linear relationship of 7 components in Yuhua tea

2.1.3 精密度

精密吸取混合对照品溶液连续进样6次，以咖啡碱为参照峰，结果各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD值分别小于0.56%和1.32%，表明仪器精密度良好。

2.1.4 稳定性

S1供试品溶液分别在0 h、4 h、8 h、16 h、24 h、32 h、48 h内各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD值分别小于0.73%和3.22%，表明供试品溶液稳定。

2.1.5 重复性

6份S1供试品溶液中各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD值分别小于0.61%和2.75%，表明该方法重复性良好。

2.1.6 加样回收率

没食子酸、表没食子儿茶素、儿茶素、咖啡碱、表儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯、表儿茶素没食子酸酯的平均加样回收率分别为96.32%、98.12%、97.77%、101.25%、99.87%、102.75%和96.32%，RSD值分别为2.39%、1.78%、3.02%、2.89%、1.64%、2.49%和2.33%。

2.2 茶样中儿茶素等活性成分及含量

12批雨花茶中7种（个）成分含量测定结果见表3。12批茶样中没食子酸、表没食子儿茶素、儿茶素、咖啡碱、表儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯、表儿茶素没食子酸酯的含量分别为2.809～3.776 mg/g、24.900～37.619 mg/g、1.771～3.452 mg/g、34.598～47.811 mg/g、12.716～14.965 mg/g、98.753～132.464 mg/g和22.370～29.978 mg/g；从上述7种（个）成分来看，茶样中表没食子儿茶素没食子酸酯的平均含量最高为115.599 mg/g，儿茶素的平均含量最低为2.706 mg/g；从茶多酚总量来看，高淳地区雨花茶的平均含量最高为261.430 mg/g，江宁地区雨花茶的平均含量次之为251.896 mg/g，溧阳和栖霞地区雨花茶的平均含量最低且两地区较为接近，分别为215.330 mg/g和217.865 mg/g。从茶多酚平均含量来看，高淳和江宁地区的雨花茶质量较优。

表3 雨花茶中7种活性成分含量测定结果Table 3 Content determination results of 7 components in Yuhua tea mg·g-1

2.3 HPLC指纹图谱的建立及相似度评价

共标定13个共有峰，生成对照指纹图谱R（图2）。12批雨花茶相似度均大于0.990，表明各批次雨花茶之间组分相似，所建立的指纹图谱质量稳定。

图2 雨花茶HPLC指纹图谱Figure 2 HPLC fingerprint of Yuhua tea

2.4 基于成分-靶点-通路的网络药理学分析

2.4.1 主要成分及其靶点

根据雨花茶的指纹图谱特征峰与定量成分，基于TCMSP、Swiss Target Prediction、PubChem、UNIPROT数据库获取没食子酸、表没食子儿茶素、儿茶素、咖啡碱、表儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯、表儿茶素没食子酸酯7个化合物的成分信息（表4），同时获取7个成分的靶点信息并去除重复靶点共得到231个靶点。基于Gene cards、OMIM数据库检索肿瘤相关靶点。将药物靶点和疾病靶点取交集，共得到134个靶点（图3）。

图3 雨花茶成分-疾病靶点交集Venn图Figure 3 Venn diagram of the intersection of Yuhua tea components and disease targets

表4 雨花茶7个成分的MOLID信息Table 4 MOLID information of 7 components of Yuhua Tea

2.4.2 成分-靶点网络图

雨花茶7个成分与134个共有靶点的“成分-靶点”可视化网络图如图4所示，该网络由141个节点和388条边组成。应用“Analysis network”对其进行网络拓扑分析，得到Degree中位数为1，Betweenness Centrality中位数为0，Closeness Centrality中位数为0.410 557 185。根据Degree值的大小，排名前三位的成分分别为表没食子儿茶素没食子酸酯（MOL006821）、咖啡碱（MOL003973）及表儿茶素没食子酸酯（MOL005467）；排名前三的靶点为PTGS1、PTGS2和ESR1，提示这些成分与靶点和肿瘤相关。

图4 雨花茶成分-靶点的网络图Figure 4 Network construction of Yuhua Tea Components and targets

2.4.3 PPI网络构建及核心靶点筛选

134个交集靶点的蛋白互作关系如图5所示。根据Degree值大小，排名前10的关键靶点依次为JUN、HIF1A、STAT3、ESR1、MAPK3、TP53、MAPK1、FOS、SP1和RELA，提示这些关键靶点可能是雨花茶抗肿瘤的核心靶点。

图5 蛋白互作网络（PPI）分析Figure 5 Protein interaction network（PPI）analysis

2.4.4 GO生物过程富集分析

通过DAVID数据库，选择人类基因对134个靶点对应的基因进行GO分析（p＜ 0.05）（图6）。结果显示，GO生物过程富集分析共富集得到2455个条目。其中BP有2224个条目，主要涉及对外来生物刺激的反应（Response to xenobiotic stimulus）、氧化应激反应（Response to oxidative stress）、细胞对化学应激的反应（Cellular response to chemical stress）等；CC共有66个条目，主要涉及细胞膜筏（Membrane raft）、细胞膜微结构域（Membrane microdomain）、RNA聚合酶II转录调节复合物（RNA Polymerase II transcription regulator complex）等；MF共有165个条目，主要涉及磷酸酶结合（Phosphatase binding）、蛋白磷酸酶结合（Protein phosphatase binding）、DNA结合转录因子结合（DNA-binding transcription factor binding）等。

图6 生物学过程（GO）富集分析Figure 6 Enrichment analysis of biological processes（GO）

2.4.5 KEGG信号通路富集分析

通过DAVID数据库，选择人类基因对134个靶点对应的基因进行KEGG生物富集分析（p＜ 0.05），如图7所示。结果显示，KEGG生物过程富集共得到165条信号通路，筛选出前20条信号通路，其中排名靠前的10条信号通路分别为前列腺癌（hsa05215）、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染（hsa05167）、胰腺癌（hsa05212）、乙型肝炎（hsa05161）、内分泌的阻力（hsa01522）、人类巨细胞病毒感染（hsa05163）、黑色素瘤（hsa05218）、非小细胞肺癌（hsa05223）、癌症中的蛋白聚糖（hsa05205）和膀胱癌（hsa05219）。KEGG富集分析结果表明，雨花茶中7个成分均与肿瘤作用关系密切。

图7 KEGG信号通路富集柱状图及气泡图Figure 7 Enrichment column and bubble diagram of KEGG signal pathway

2.4.6 雨花茶成分-靶点-通路的可视化网络关系

构建了雨花茶的“成分-靶点-通路-疾病”的网络关系图。如图8所示，绿色部分代表雨花茶及其7个成分，蓝色部分代表靶点，橙色部分代表通路及疾病。由图可知，图形面积大小与Degree值呈正相关。排名前10的靶点分别为TP53、CDKN1A、MAPK1、MAPK3、MAP2K1、RAF1、E2F1、AKT1、CCND1和RB1，提示这些靶点可能是雨花茶抗肿瘤的重要靶点。

图8 成分-靶点-通路的网络图Figure 8 Network diagram of components-targets-pathways

3 结论与讨论

3.1 讨论

雨花茶作为我国十大名茶之一，具有清热解毒、利尿通便、提神明目等多重功效。唐代《新修本草》中记载：“茗味甘、苦，微寒，无毒。主瘘疮，利小便，祛痰热渴。”临床上已有包含茶多酚提取物的心脑健胶囊用于高血脂、高血压、头晕目眩等症状的治疗。目前，已有文献应用网络药理学方法研究茶叶抗癌的作用机制，但尚未有指纹图谱结合网络药理学的研究方法对雨花茶抗肿瘤作用机制的研究。本研究在前期研究基础上建立了不同产地雨花茶指纹图谱及儿茶素组分的含量测定方法。结果发现，不同产地雨花茶中儿茶素组分含量差异较大，表没食子儿茶素没食子酸酯为雨花茶中含量最高的成分，儿茶素为含量最低的成分。

本研究利用网络药理学方法构建了“雨花茶成分-靶点-疾病通路”的网络，探究雨花茶抗肿瘤潜在分子作用机制，得到7种成分的134个潜在靶点和165条信号通路。7种成分中，表没食子儿茶素没食子酸酯、咖啡碱、表儿茶素没食子酸酯三个成分在网络中作用较大。已有研究表明，表没食子儿茶素没食子酸酯可以通过促进抑制癌症基因的表达、诱导细胞凋亡、调节甲基化水平，影响多条信号通路等多种途径发挥其抗肿瘤效应[22]。咖啡碱具有兴奋中枢神经、促进血液循环、利尿和醒酒作用[23]，亦有研究表明[24-25]咖啡碱能保护肉毒碱抵抗细胞性神经肿瘤病和抑制肝细胞性肝癌干细胞的增殖，诱导细胞凋亡，从而增强对肝癌干细胞的杀伤作用。表儿茶素没食子酸酯在芳基乙酰胺脱乙酰酶的代谢中具有特异性抑制作用[26]，同时对于B16F10黑素瘤细胞中黑素的生成具有明显抑制作用[27]。可见，茶叶中的儿茶素等成分具有抑菌、消炎、降“三高”和抗肿瘤等多重作用，对于抵抗多种肿瘤细胞具有潜在的防治作用。

根据PPI蛋白互作得到的核心靶点中，排名前十的靶点为JUN、HIF1A、STAT3、ESR1、MAPK3、TP53、MAPK1、FOS、SP1和RELA，说明这些靶点具有重要作用。JUN和FOS蛋白组成的AP-1转录因子，可通过调节含有AP-1结合位点靶基因的转录表达，从而调节肿瘤细胞的增殖、分化以及肿瘤血管生成及肿瘤转移[28]。缺氧诱导因子1A（HIF1A）是肿瘤缺氧信号通路的中枢调节因子，可参与血管新生、糖酵解、红细胞生成以及在细胞的增殖、侵袭和迁移中发挥作用[29]。细胞信号转导和转录激活因子3（STAT3）是一条双重功能信号通路，可通过介导细胞的恶性转化、参与肿瘤的增殖、分化、血管生成、侵袭转移和免疫逃避等多项生理调节[30-31]。雌激素受体α（ESR1）基因与乳腺癌的发生、发展、转移和治疗反应密切相关[32]。丝裂原活化蛋白激酶3/1（MAPK3、MAPK1）信号通路对于LH诱导的卵母细胞减数分裂、排卵和黄体的生成必不可少[33]；同时MAPK1在癌症形成过程中发挥重要作用，如在卵巢癌中MAPK1过度激活可促进癌细胞的增殖侵袭及迁移[34]。TP53作为一个抑癌基因，突变频率较高，在晚期非小细胞肺癌中大约50%存在突变失活，研究已证实TP53基因发生突变后肿瘤往往更具侵袭性，预后较差，因而我国人群中TP53突变可能是晚期非小细胞肺癌不良预后因素[35]。特异性蛋白1（SP1）作为一种转录因子，可通过结合RNA和调节转录稳定性的能力从而影响癌症。研究表明SP1通过促进ARRB1表达促进细胞凋亡，从而抑制T-ALL进程[36]。真核细胞转录因子（RELA）通过调节多种靶基因的表达，参与炎症因子、免疫反应和肿瘤细胞的凋亡、增殖和分化的调控，RELA还可通过磷酸化、乙酰化和甲基化等修饰后精准调控NF-κB的转录活性，在调节炎症、肿瘤、代谢等重要生理活动中发挥重要作用[37]。

3.2 结论

雨花茶中的成分可能通过JUN、HIF1A、STAT3、ESR1、MAPK3、TP53、MAPK1、FOS、SP1、RELA介导肿瘤相关通路和NF-κB信号通路，参与炎症反应与发挥免疫调节、抗氧化、抗缺氧、抗肿瘤等作用。本研究首次采用指纹图谱结合网络药理学探究雨花茶抗肿瘤的作用机制，并测定其中7种活性成分的含量，可为基于抗肿瘤作用的雨花茶等茶的质量控制等提供参考依据。