周璇，王璐，谢跃

(四川农业大学动物医学院，四川 成都 611130)

寄生虫小G蛋白(small G-proteins或small GTPases)是一类分子量介于20～40 kDa、具有GTP酶活性的单体蛋白[1]。作为细胞信号传导的“分子开关”，寄生虫小G蛋白可将虫体细胞外信号与细胞内信号偶联，介导寄生虫营养、发育与寄生等重要生理过程[1-2]。在结构上，寄生虫小G蛋白由5个Α-螺旋(A1～A5)，6个Β-链(B1～B6)及5个多肽环(G1～G5)组成[3]，拥有5个“G域”，包括G1(GXXXGKS/T)、G2(T)、G3(DXXGQ)、G4(N/TKXD)和G5(S/CAK/L/T)[2-4]。另外，寄生虫小G蛋白还有2个高度灵活的靶蛋白识别区域SWITCH Ⅰ和SWITCH Ⅱ[5]。根据FASEB RAS-LIKE GTPASE综合命名法[6]，目前寄生虫小G蛋白可分为RAS、RHO、RAB、ARF和RAN 5个家族[7]。以秀丽隐杆线虫(Caenothabditiselegans)56种小G蛋白为例，运用极大似然法构建系统进化树，如图1所示，虫体RAB、ARF家族小G蛋白成员居多。研究表明，寄生虫小G蛋白RHO家族参与调控虫体细胞骨架重组、细胞极性、生物信号转导等生理功能[8-10]；RAB和ARF家族在调节虫体细胞高尔基体运输、囊泡运输和细胞吞噬过程中有突出作用[11-13]；RAN家族调控虫体细胞核质运输、微管形成、细胞核膜的组装[14]以及蛋白质运输到鞭毛/纤毛过程发挥关键作用[15]。除维持寄生虫细胞的正常生理功能外，Jex等[16]报道猪蛔虫(Ascarissuum)的46个小G蛋白可以作为潜在的抗寄生虫疫苗候选蛋白；Zhu等[17]证实犬弓首蛔虫(Toxocaracanis)小G蛋白是新的理想抗寄生虫药物研制靶点；Heng等[18]发现刚地弓形虫(Toxoplasmagondii)小G蛋白Rab5在微孔分泌中具有运输功能。尽管如此，目前有关寄生虫小G蛋白的研究仍缺乏系统、全面的归纳、分析和总结，为此本论文拟在介绍小G蛋白家族的基础上，综述近年来寄生虫小G蛋白的研究现状和进展，并提示小G蛋白可以作为一种新型抗寄生虫药物靶点候选，以期为寄生虫病药物预防和治疗提供信息参考。

注：不同颜色代表不同的小G蛋白家族。

1 RAS家族

RAS是小G蛋白超家族的创始成员，整个超家族几乎都含有RAS结构。RAS家族主要参与寄生虫的信号转导，然而因其结构的保守性和功能的复杂性，目前有关寄生虫RAS家族的研究主要集中在其介入的信号传导通路方面，相关成员包括Let-60、RAP和RAL，它们广泛参与并介导了寄生虫的性器官发育、性腺的信息传递、成肌细胞迁移、P12细胞的转化以及产卵器形成等重要生理过程[19-25]。研究表明，寄生虫Let-60与哺乳动物H-、N-和K-RAS同源，且在寄生性线虫旋盘尾丝虫(Onchocercavolvulus)高度表达，推测该蛋白可能作为丝虫与其共生菌沃尔巴克氏体互惠关系的重要信号物质[20]。另外，研究还发现，寄生虫Let-60基因可以介导虫体产卵前体细胞EGF的信号传导，其异常表达会导致无产卵器突变虫体(Vulvaless)和多产卵器突变虫体(Multivulva)的产生。例如，在科氏中殖孔绦虫(Mesocestoidescorti)幼虫和成虫的蛋白质比较组学分析中，研究人员发现Let-60作为该绦虫主要的细胞内信号调节因子，仅在幼虫期中表达，且呈现生长阶段的特异性，推测其可能与表面受体酪氨酸激酶一起参与了胰岛素或胰岛素样信号的转导，因此作为科氏中殖孔绦虫阶段特异性发育的潜在标志物[21]。相比Let-60，寄生虫RAP蛋白包含RAP1和RAP2两个亚类，且二者可以通过形成效应体，影响连接生物学和形态发生过程。研究报道，RAP-2参与了华支睾吸虫(Clonorchissinensis)虫体的分化与繁殖等过程[22]，而RAP1和RAP2则可共同调控秀丽隐杆线虫幼虫的蜕皮过程[23]。相对于Let-60和RAP蛋白，RAL则主要参与多种细胞关键过程的调控，如内吞作用和肌动蛋白-细胞骨架动力学等。Spliotis等[24]发现，多房棘球绦虫(Echinococcusmultilocularis)的Em-RAL在中绦期和原头蚴时期表达，且中绦期略高于原头蚴时期，推测Em-RAL可能参与原头蚴活力以及棘球蚴新生包囊壁的形成，是多房棘球绦虫的幼虫发育过程中的关键蛋白。基于RAS在寄生虫的信号转导方面的突出作用，阻断此类蛋白的信号传递可能成为研究新型抗寄生虫药物的方向。

2 RAB家族

RAB家族蛋白是细胞内囊泡运输的重要调控蛋白，参与了寄生虫的宿主入侵、信号转导、结构发育等重要生理功能(表 1)。目前有关寄生虫RAB家族的研究主要集中在刚地弓形虫(T.gondii)[26-27]、疟原虫(Plasmodiumspp.)[28]、锥虫(Trypanosomaspp.)[29-32]、利氏曼原虫(Leishmaniaspp.)[33]等原虫。通过对顶复门原虫RAB家族蛋白的基因序列比较分析发现，原虫间的Rab基因种类存在着较大差异，如弓形虫和新孢子虫属有15个不同的Rab基因，疟原虫属有11个Rab基因；而泰勒虫属和巴贝斯属缺少Rab5B和Rab18，仅有9个Rab基因[27]；对于隐孢子虫属，除了缺少Rab5B和Rab18，还缺少Rab5A，为此仅有8个Rab基因。进一步基于Rab部分氨基酸序列的系统发育发现，泰勒虫属Rab1A与Rab6聚类，而与隐孢子虫属、疟原虫属Rab1A亲缘关系较远。另外，研究人员还发现，泰勒虫属和隐孢子虫属缺少Rab5B蛋白，因此不能发生C端香叶基香叶基化(geranylgeranylation)[27]。有趣的是，在恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum)Rab5A和Rab5B的氨基酸序列中，PfRab5A的RabF1和RabF2序列之间似乎插入30个氨基酸残基，而这特殊的插入序列在泰勒属、巴贝斯属及弓形虫中未曾发现[27]。相较PfRab5A而言，恶性疟原虫PfRab5B缺乏丙烯基化所必需的C端，取而代之的是一个编码N端肉豆蔻酰化位点的C端，这种显著的氨基酸组成差异推测可能与疟原虫的某些特殊生物学功能相关。

研究表明，激活寄生虫Rab5可以招募并活化Rab7，而活化Rab7又可反向灭活并移除Rab5[34-35]。由此，研究人员采用RNAi技术，通过延时差分干涉对比(DIC)显微镜，观察虫体胚胎前2次分裂中Rab5或Rab7基因的表达情况，结果发现，与野生型胚胎相比，Rab5或Rab7表达缺失会导致有丝分裂纺锤体倾向于后极，以致AB和P1分裂之间的异步性增加；同时Rab5的缺失，还会在极性建立阶段影响PAR6的定位和细胞皮层的动态。鉴于PAR蛋白本身作为细胞内吞作用的正调节蛋白，因此推测Rab5和PAR蛋白之间可能存在反馈调节机制，进而可以调节极性和肌动蛋白细胞骨架的构成，形成以动力蛋白依赖和非依赖性的方式，促进虫体的胚胎极性[35]。相比Rab5的肌动蛋白细胞骨架调控功能，Rab6作为一种与高尔基体相关的GTPase，被视为招募分离酶到寄生虫胚胎皮质颗粒的关键蛋白[36]。试验敲除Rab6.1基因，可导致皮质颗粒胞外分泌的膜融合阶段出现异常；同时Rab6.1也被视为卵母细胞向胚胎转化过程中皮层颗粒及时胞外排泄的一种重要分子。在溶组织阿米巴原虫编码的9个Rab7蛋白(Eh-Rab7A至Eh-Rab7I)中，Saito-Nakano等[13]和Nakada-Tsukui等[37]一致发现，Eh-Rab7A和Eh-Rab7B在溶酶体和吞噬体的定位和生物发生中的作用上存在明显差异，即Eh-Rab7A位于后高尔基区，在吞噬30 min后被运输到含红细胞的吞噬体中，而Eh-Rab7B位于核内体或溶酶体则“被动”进入含有红细胞的吞噬体；过表达Eh-Rab7B-GTP可显著降低细胞内半胱氨酸蛋白酶 (CP)活性，而Eh-Rab7A过表达可导致溶酶体增大，细胞CP活性增加。由此可见，2种Rab7蛋白在溶酶体和吞噬体的生物发生中发挥着不同但相互协调的作用。

此外，Rab8是除拟柔毛虫属(贾第虫属)和滴虫属(阴道毛滴虫属)之外真核生物高度保守的RAB家族成员。Hanadate等[38]在对阿米巴原虫细胞吞噬作用机制研究时发现，Rab8主要存在于虫体的内质网(ER)，可通过介导转运表面受体(PM)参与吞噬作用，沉默或抑制Rab8表达可下调阿米巴原虫细胞吞噬功能。相对于Rab8，Rab10富集在虫体形成的WEIBEL-PALADE小体(WPB)中，Rab10对血管假性血友病因子(von Willebrand factor，VWF)的分泌非常重要。研究显示，Rab10可与EXO70、EXO84等细胞外囊功能调节因子共同参与寄生虫肠道上皮细胞内运输功能[39]。相较Rab8和Rab10，原虫Rab11包含3个成员，即Rab11、Rab11B和Rab11C，在阿米巴原虫Rab11的免疫荧光亚细胞定位中，Eh-Rab11在滋养体细胞质中呈点状分布[40]。通常囊泡运输在阿米巴原虫的毒力作用中起着关键作用，而Eh-Rab11B又在其主要毒力因子半胱氨酸蛋白酶的分泌中起核心作用。为此，Mitra等[11]对Rab11在致病因子的运输和分泌中的中心作用进行了探究，并发现Eh-Rab11B不能与内质网、早期核内体和溶酶体的标记物共定位，表明该Rab11可能在这些细胞器之间的囊泡运输中不起作用，但与内吞通路中的非酸化囊泡部分相关；过表达Eh-Rab11B导致细胞内和分泌的半胱氨酸蛋白酶活性显著增加，同时细胞溶解活性增强，这表明Eh-Rab11B可能增强虫体对哺乳动物细胞的破坏能力。之后，Agop-Nersesian等[26]发现Rab11B在顶复门寄生虫中能够特异性地将高尔基体衍生的囊泡运输到生长中未成熟细胞的内膜复合体(IMC)中，因此推测Rab11B可能是顶复门寄生虫生长发育的重要因子；相反 Rab11A与肌凝蛋白-尾部相互作用蛋白(MTIP)结合，是一种被称为滑模体4的蛋白运动复合物的成员之一，在寄生虫入侵宿主细胞过程发挥至关重要的作用[41]。

3 RHO家族

RHO家族根据结构和功能不同可以分为RHO、CDC42、RAC、RND和RHOBTB 5个成员。目前有关寄生虫RHO家族的报道多见于RHO、CDC42、RAC，它们主要在寄生虫胞质骨架构建方面发挥着重要作用，并同时参与虫体发育基因的表达调控[42-43]。研究表明，寄生虫RHO通过调控虫体细胞信号传导，影响肌动蛋白与细胞骨架结构、基因转录、细胞周期进程以及膜运输(表 1)。Thomas等[10]发现曼氏血吸虫(Schistosomamansoni)RHO在雌虫高度表达，并通过信号传导调控蛋白质异戊烯化(prenylation)，影响成虫的致病过程。Melo等[43]使用NIH-3T3成纤维细胞构建克氏锥虫RHO1-G15V和RHO1-Q76L突变体，经细胞-底物黏附试验表明，RHO-1阳性的NIH-3T3突变细胞系具有增强的底物黏附表型，证实RHO-1可能调节克氏锥虫的底物黏附，在虫体入侵过程发挥关键作用。在C.elegans中，RHO-1的不对称分布会影响皮质肌动球蛋白的流动，致使PAR-3和CDC-42移位到前皮质层，而极化的CDC42则对已建立的前皮质层功能进行调节[44]。进一步研究发现，线虫CDC42与PAR-3/PAR-6和PKC-3复合体的相互作用是蛋白不对称分布和胚胎极性维持的必要条件[45]。在C.elegans减数分裂完成后，CDC42会将PAR-2从皮质中移除，并将PAR-6定位至皮质[46]。在细小衣原体(Chlamydiaeparvum)中，虫体可以通过PI3K/frabin途径激活CDC42，引起宿主细胞肌动蛋白细胞骨架重塑，介导虫体入侵过程[47]；在旋毛虫中，CDC42表达于虫体新生幼虫、肌幼虫和成虫阶段，借助RNAi技术，研究人员证实旋毛虫CDC42可能参与虫体发育，且与其生殖与排卵数密切相关[48]，犬钩口线虫中也证实该类蛋白在调节虫体生长发育中至关重要[49]。相比RHO和CDC42，RAC不仅参与细胞极性，还与细胞正常分裂相关。研究表明，阿米巴原虫RAC-G与人的RAC1同源，可诱导典型的RAC表型，如果RAC-G-V12发生突变可以导致细胞极性失调、细胞分裂缺陷以及F-actin细胞骨架模式变化[50]。有趣的是，相似的发现存在克氏锥虫之中，表明RAC-G可能在原虫的形态发生和细胞分裂中发挥重要作用[8]。

4 ARF家族

ARF家族包括ADP核糖基化因子ARF以及ADP核糖基化因子样蛋白ARL。目前已有研究报道二者可能参与寄生虫细胞骨架的装配、高尔基体维持以及胞吐作用，并同时介导诸如捻转血矛线虫(H.contortus)[51]、锥虫(Trypanosomaspp.)[52-54]、刚地弓形虫(T.gondii)[55]、利氏曼原虫(Leishmaniaspp.)[56]、溶组织阿米巴原虫(E.histolytica)[57]等对宿主入侵过程(表 1)。譬如，Gadahi等[51]证实，捻转血矛线虫ARF-1不仅可显著抑制山羊外周血单核细胞(PBMCS)的增殖，诱导以IL-4、IL-10和IL-17细胞因子分泌为主的Th2免疫反应，还可以对宿主细胞迁移和NO的产生有促进作用。另外，克氏锥虫ARF可以通过参与经典的分泌路径，协助虫体入侵宿主[52]；在布氏锥虫中，ARL-1被认为是虫体血液寄生阶段必要蛋白[53]，ARL-1缺失可直接导致虫体形态异常，形成多鞭毛或多核个体；同时ARL-1缺失还会导致高尔基体结构崩解，产生大量囊泡。结合这一特点，我们建议在研制抗锥虫药物时可将该蛋白作为一个潜在药物靶点。另外，寄生虫ARL-2作为微管生物发生的调节剂，与虫体微管蛋白特异性伴侣辅因子D结合，并参与寄生虫线粒体BART和ANT-1蛋白的相互作用[54]。众所周知，布氏锥虫的乙酰化微管蛋白广泛发生于虫体的所有微管阵列，包括核内有丝分裂纺锤体，然而这种翻译后修饰却似乎滞后于微管形成，反向去乙酰化过程则可缓解该过程。Price等[54]利用RNAi技术调控布氏锥虫ARL2表达，通过表达TBARL2MYC和TBARL2NOTAG，发现虫体总微管蛋白强度显著增加，证实ARL-2表达水平可以抑制卵裂沟的形成，导致严重的细胞分裂缺陷，同时ARL-2的表达水平也可触发细胞微管中乙酰化的Β-微管蛋白丢失。而弓形虫ARF6可以激活PI-3激酶信号通路，动员PIP2和PIP3进入宿主液泡中，参与虫体对宿主入侵行为[55]。相对于ARF，在已报道的多个寄生虫种中，研究人员发现ARL-1在利氏曼原虫2个生活史阶段——昆虫期前鞭毛体和哺乳动物期无鞭毛体中均有显著表达[56]。鉴于ARL-1主要分布于高尔基体反面的网络结构中，研究人员推测ARL-1可能参与了虫体高尔基体结构维持和胞吐等生理活动。同样，在溶组织阿米巴原虫中，EhArfX2也呈现出相似的组织定位和潜在功能[57]。

另外，研究人员发现，C.elegansevl-20基因(ARL-2同源基因)突变除了可以导致雌虫产卵器、雄性尾巴、性腺以及胞质分裂发育异常，还可以破坏胚胎增殖，影响皮下封闭和伸长，造成微管细胞骨架功能缺陷。可见，Arl-2对寄生虫微管形成具有重要的调节作用[58]。目前相关研究人员在C.elegans的Arl-3和Arl-13的研究中发现两种蛋白不仅参与细胞内信号传导，还对维持虫体正常生理功能具有重要调节作用[59]。

5 RAN家族

研究表明，RAN蛋白家族负责调控多种与细胞核有关的生理活动，包括核质运输、纺锤体的形成及核膜的重建等[60-61]。寄生虫RAN蛋白主要参与寄生虫胚胎期发育的调控，包括虫体DNA的复制、转录及翻译(表1)。研究证实，人工干扰C.elegansRAN，可导致虫体有丝分裂后期形成的胚胎细胞出现核膜重组失败，影响后代的形成[60]。此外，研究人员发现布氏锥虫鞭毛和FAZ近端基的双叶结构上存在富含亮氨酸的重复蛋白1(LRRP1)，该蛋白对鞭毛附着区(FAZ)复合体的生物发生至关重要，可影响鞭毛驱动的细胞运动和分裂。研究人员通过细菌表达的GST-LRR和His-Ran验证了LRRP1的N端LRR域与RAN相互作用，RAN通过C端RanBD与RanBPL相互作用，从而形成复合物调控布氏锥虫中Ran-GTP的水解过程，证实RAN可以调节布氏锥虫鞭毛功能[15]。

表1 寄生虫小G蛋白功能

6 RJL新家族

RJL家族是近年来发现的小G蛋白新家族，目前已报道的家族成员有2个，即RJLs和RBJ。Rjls基因广泛存在于原生动物谱系，编码一个核心GTPase结构域；而Rbj基因产物则存在于鞭毛虫/后生动物谱系[62]。截止目前，RJL家族是小G蛋白家族中唯一拥有除了小G蛋白G-结构域外，还包含一个额外DnaJ结构域的家族。2019年，Gao等[7]对RBJ蛋白的晶体结构进行解析，证实上述2个域独立折叠，并由1个高度灵活的铰链区域连接。另外，部分学者推测热休克蛋白70(Hsp70)可能是RBJ的一个效应蛋白，这为后续RBJ及其相关信号通路研究和药物设计提供了重要的分子基础。

在RJL家族功能研究方面，Elias等[63]通过重新构建各种真核生物RJL家族系统发育树发现，RJL家族在真核生物进化过程中存在多次丢失的现象，并最终在真核生物的最后一个共同祖先被保留。有趣的是，RJL在所有缺乏鞭毛的原生动物类群和一些鞭毛结构异常或减少鞭毛的谱系中都缺失，这提示RJL蛋白在功能上可能与鞭毛的功能有关。另外，Chen等[64]突破性发现RBJ在肿瘤细胞核内可直接结合信号分子MEK/ERK(2种蛋白激酶)，将其锚定于细胞核，使其陷入不能出核，从而造成促癌信号分子在细胞核内遗传聚集，导致下游细胞生长基因异常活跃，促进肿瘤恶性生长。值得注意的是，在人的胃肠癌中，Rbj基因也表现异常活跃，而抑制该基因则可显著控制降低肿瘤细胞的生长。随后，研究人员还发现，RBJ可以介导ERK1/2核组成的激活，致使IL-6的持续产生和MDSCs的增加，从而促进肿瘤细胞的生长和转移，因此推测RBJ可能参与肿瘤细胞的免疫逃避过程。尽管如此，有关RJL家族在寄生虫领域的研究却鲜有报道，仅锥虫RJL被证实位于动基体附近，可与GTP结合，参与锥虫的生长和分化过程[65-66]。

7 展望

近年来，随着分子生物学技术的不断发展，小G蛋白及其家族成员在生物基因调控、囊泡运输、细胞骨架维持等方面的作用正变得越来越清晰，然而寄生虫小G蛋白的研究仍相对滞后，尚待深入研究。目前有关寄生虫小G蛋白功能研究多局限于原虫(如锥虫、利氏曼原虫、阿米巴原虫、刚地弓形虫)，而有关寄生蠕虫的研究则相对较少，推测可能与原虫虫体小(单细胞)，蛋白突变体易构建，且多数种类可以进行体外培养等因素有关。考虑到寄生虫小G蛋白广泛参与虫体生长发育、虫体结构形成以及寄生虫与宿主相互作用，且大量寄生虫(尤其是寄生蠕虫)基因组、转录组、蛋白组、分泌组、代谢组被陆续破译，小G蛋白与寄生虫以及寄生虫与宿主之间的关系势必将被慢慢解析。这些多元且丰富的分子生物学信息将为探寻抑制寄生虫繁殖、生长的药物靶点以及研发阻断寄生虫病原传播的疫苗提供理论和数据参考。