沈宇娟,陈海艳,童陆媛,张玲艳,钟剑峰,童照威,王伟洪

(湖州市中心医院 感染科,浙江 湖州 313000)

0 引 言

慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)是由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染引起的肝脏损害性慢性传染性疾病,进一步发展可导致肝硬化、肝衰竭、肝癌等,严重危害人类的身体健康及生命安全[1].共价闭合环状DNA( cccDNA)的持续存在是导致HBV感染慢性化、CHB久治不愈和停药后容易复发的主要原因.研究发现,肝组织内检测不到cccDNA是判断HBV感染彻底治愈的一项重要指标[2-3].然而,目前以 cccDNA 检测为目的的肝穿刺活组织检查难以在临床上普遍开展.

血清HBV RNA是近年发展起来的新型HBV病毒学指标.我国《慢性乙型肝炎防治指南(2019 年版)》[4]和欧洲肝病学会(European Association for the Study of the Liver,EASL)的《乙型肝炎病毒感染管理临床实践指南(2017 年版)》[5]指出,血清HBV RNA 水平可反映肝组织 cccDNA 转录活性,与患者的病毒学应答及预后相关.2022年,中华医学会肝病学分会发表的《慢性HBV感染者血清HBV RNA检测及临床应用的专家共识》[6]提到,血清 HBV RNA 是反映肝内 cccDNA数量和遗传组成及其转录活性的无创性标志物,在临床应用方面可用于指导患者停用核苷(酸)类似物(NAs).对符合现行停药标准的接受巩固治疗的CHB 患者,若其血清HBV RNA检测为阳性,则应持续进行抗病毒治疗,以避免停药带来的疾病复发风险.

本研究对经NAs治疗达到HBeAg阴转,且HBsAg<1 500 IU/mL的CHB患者进行HBV RNA水平检测,并分析HBV RNA水平与其他标志物的关系,从而探讨CHB患者的可能停药指标.

1 资料与方法

1.1 研究对象

临床资料来源于2021年1月至2022年6月在湖州市中心医院感染科就诊的CHB患者,其符合《慢性乙型肝炎防治指南(2019版)》[4]的诊断标准,经NAs治疗,HBV DNA低于检测下限(20 IU/mL),发生HBeAg阴转,且HBsAg低于1 500 IU/mL.本研究已经本院伦理委员会审核批准(20181104-01).

排除标准:①肝硬化、肝衰竭和肝癌患者;②合并有HAV、HCV、HEV或HIV感染的患者;③合并有酒精肝、非酒精性脂肪肝、药物性肝炎、自免肝等的患者;④妊娠和哺乳期妇女;⑤合并有其他严重器质性疾病和其他基础疾病的患者.

1.2 主要试剂与仪器

高敏 HBV-DNA 检测采用罗氏 COBASAmpliPrep/COBAS TaqMan48 病毒载量系统,试剂盒购自罗氏诊断公司;血清 HBsAg 、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc检测采用雅培公司生产的ARCHITECT i2000全自动电化学发光免疫分析仪,试剂购自雅培公司;肝功能检测采用安图公司生产的A2000 Plus生化分析仪,试剂购自安图公司;血常规检测采用SYSMEX/森希美康公司生产的 XE-2100血细胞分析仪,试剂购自SYSMEX/森希美康公司;HBV RNA水平检测采用广州海力特生物科技有限公司的试剂盒.该试剂盒标准品为包含重组目的序列的假病毒,通过将信号与标准曲线对比来量化HBV RNA,600 μL检测样品的最低检测下限为15 copies/mL,线性范围为5×101～1.0×108copies/mL.

1.3 临床观察指标

患者的年龄、性别、抗病毒治疗时间、乙肝家族史等一般基线资料;HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc等病毒学指标;丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、总胆红素、碱性磷酸酶(ALP)、γ-谷氨酰转肽酶(GGT)等生化资料,以及白细胞和血小板.

1.4 统计学分析

所有资料经量化后建立数据库,使用SPSS 25.0统计软件进行数据统计分析,服从正态分布的计量资料用(x±s)表示,比较分析采用独立样本T检验;呈偏态分布的计量资料用M(Q1,Q3)表示,比较分析采用曼惠特尼U检验;单因素分析中P<0.05的变量纳入二元Logistic;相关性分析采用Spearman相关性分析方法,P<0.05表示差异有统计学意义.

2 结 果

2.1 患者的一般基线资料

共收集CHB患者286例,符合纳入标准的有160例,其中男性109例、女性51例,年龄在29～74岁之间,平均为50.5±10.9岁.同期纳入家族史情况,以及HBsAg、抗HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc、HBV RNA、丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶、总胆红素、碱性磷酸酶、γ-谷氨酰转肽酶、白细胞和血小板等检测数据.详细情况见表1.

表1 患者的一般基线资料

2.2 影响CHB患者HBV RNA检出的单因素分析

在入组的160例CHB患者中,HBV RNA检出率为48.75%.按HBV RNA是否检出将患者分为HBV RNA阳性组(检出HBV RNA,为1)和HBV RNA阳性组(未检出HBV RNA,为0).单因素分析结果见表2,HBV RNA阳性组的HBsAg和ALT水平高于HBV RNA阴性组,组间差异有统计学意义(Z=-3.81、-2.493,P<0.05);两组的性别、乙肝家族史、年龄、治疗时间、抗HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc、天门冬氨酸氨基转移酶、总胆红素、碱性磷酸酶、γ-谷氨酰转肽酶、白细胞和血小板,差异无统计学意义(P<0.05).

表2 影响CHB患者HBV RNA检出的单因素分析

2.3 影响CHB患者HBV RNA检出的二元Logistic分析

以单因素分析中有统计学意义的因素作为多因素分析的自变量,采用二元Logistic回归进行多因素分析,发现HBsAg和ALT均是影响HBV RNA检出的独立影响因素(OR=1.001、1.048,P<0.05)(表3).

表3 CHB患者中影响HBV RNA检出的二元Logistic分析

2.4 CHB患者血清HBV RNA水平与其他因素的相关性

采用spearman分析HBV RNA与HBsAg、抗-HBs、抗-HBe、ALT、AST等的相关性,结果提示,HBsAg与HBV RNA存在显著正相关(r=0.248,P<0.001).

3 讨 论

强效、低耐药NAs的广泛应用可抑制大部分CHB患者的HBV DNA水平,明显改善患者的预后[7-8],但其对cccDNA无直接抑制与清除作用.肝脏内留存的cccDNA容易导致病毒持续复制,从而造成乙肝难以治愈.NAs的长期应用在增加药物不良反应同时,也会加重社会经济负担.目前,非肝硬化患者应用NAs治疗的时间存在较大差异,其主要问题是停药后存在病毒学及临床复发,甚至失代偿风险[9-10],故国内外学者都致力寻找一个能够较好反应cccDNA水平且临床容易获取的指标.

HBV RNA主要由肝细胞核内的cccDNA模板转录而来,可用于反映肝细胞内cccDNA的拷贝数量和转录活性,以及预测病毒学应答及安全停药[11-15].在经治CHB患者中,HBV RNA与其他病毒学指标的是否存在相关性,学界内对此还存在较大分歧.目前普遍认为,经NAs治疗后,HBV RNA水平与HBsAg的相关性会逐渐下降甚至消失[16-17].近期多项研究也持有不同意见.王春妍[18]等发现,经NAs长期治疗后,HBV DNA低于检测下限的肝硬化患者的HBsAg与HBV RNA存在相关性;施欢欢[19]对长期经NAs治疗的CHB患者进行HBV RNA与HBsAg的相关性分析,结果表明两者之间具有显著的相关性;一项发表于gut的研究报道,血清中HBV RNA 检测对决定CHB患者,尤其是低HBsAg水平患者是否停用抗病毒药物治疗至关重要[20].因此,HBV RNA与其他病毒学指标的关系还需进一步探索[21].

本文对经NAs治疗,HBV DNA低于最低检测下限,已发生HBeAg阴转,且HBsAg<1 500 IU/mL的CHB患者进行血清HBV RNA水平检测,发现仍有48.75%的患者检出HBV RNA.筛选影响HBV RNA检出率的因素,发现HBsAg水平相对较高的患者存在较高的HBV RNA检出率,ALT水平也影响HBV RNA的检出率.相关性分析提示,HBV RNA水平与HBsAg水平存在正相关.这可以说明以下几个问题:

(1) 患者中有近一半仍可检出HBV RNA,说明在HBV DNA低于下限时停药还为时过早,高水平的HBV RNA提示,其肝内cccDNA活性仍然偏高,HBV复制能力仍然活跃.相比HBV DNA,HBV RNA在监测NAs治疗期间的病毒学应答更有优势.

(2) 目前认为HBsAg消失可作为 CHB 功能性治愈的替代指标.但有研究[22]显示,CHB 患者的肝细胞内存在 HBV DNA 整合,当HBV 被清除后,整合的 HBV DNA 可表达 HBsAg.因此,在 CHB 患者的肝组织和血清中,很可能持续存在由整合 HBV DNA 表达的 HBsAg.而HBV RNA仅由cccDNA产生,因此可直接反映肝内 cccDNA 的存在水平及转录状态.

本研究发现,HBsAg 水平与HBV RNA 的检出率有关,且与HBsAg水平呈显著正相关,HBsAg滴度越低,HBV RNA水平越低.这与王春妍、施欢欢等的研究结果一致[18-19].本研究还发现,ALT与HBV RNA的检出有关,在检出HBV RNA的标本中,ALT水平略高于HBV RNA未检出者.ALT是目前乙肝治疗随访中最常用到的指标,ALT的高低能够反应肝细胞的损伤程度.乙肝抗病毒治疗ALT的适应证越来越宽泛,从原先的ALT>2倍上限需要治疗,到ALT反复波动即需启动抗病毒方案,再到ALT正常的乙肝抗病毒也需根据多因素综合评判.本研究结论说明,ALT维持在略低水平可能更有利于HBV RNA的下降.

近年来,有关HBV RNA的研究越来越多,它在CHB患者中的作用已得到验证.本研究发现,针对经NAs治疗后HBV DNA低于检测下限,且发生HBeAg阴转后的CHB患者,有必要进一步检测其HBV RNA水平,并联合HBsAg和ALT来指导临床停药及观察疗效.本研究还存在不足,未来研究需要考虑多中心、大样本,排除地区种族及治疗方案等混杂因素.