陈攀攀 王 颖 郭得政 郗学鹏 王红芳 胥保华 刘振国*

(1.山东农业大学动物科技学院,泰安 271018;2.山东农业大学生命科学学院,泰安 271018)

蜜蜂是自然界最重要的传粉媒介昆虫。世界上约400种农作物部分或全部依赖蜜蜂或其他昆虫授粉[1],提供全球90%食物的100种作物中,有70多种是由蜜蜂授粉的[2-3]。在养蜂生产中,蜜蜂常面临转地运输、高温等环境胁迫[4-5],导致幼虫发育不良、成年蜜蜂暴躁和采集积极性下降等,给养蜂效益带来不利影响[6]。因此,研究一种能缓解蜜蜂高温胁迫的添加剂迫在眉睫,而养蜂业中有关缓解蜜蜂高温胁迫的研究鲜有报道。

牛磺酸又称β-氨基乙磺酸,是动物体内一种可溶于水、对热稳定的含硫氨基酸,主要存在于动物组织(包括大脑、视网膜、肌肉和全身器官)[7]。牛磺酸具有抗高温胁迫作用和营养调节功能,已在畜牧生产中广泛应用。研究显示,牛磺酸具有上调肉鸡空肠组织热休克蛋白70(HSP70)表达的作用[8];在虹鳟遭受热刺激时,牛磺酸减轻了机体热应激反应[9];在热应激条件下,牛磺酸对果蝇中的处女蝇的寿命有延长作用[10];在仔猪的饲粮中添加牛磺酸,具有增加机体抗氧化能力的作用[11];牛磺酸可显著改善慢性应激导致的大鼠行为学异常,减轻焦虑恐惧情绪[12],这表明牛磺酸具有抗应激作用。动物体中牛磺酸的来源主要有2个:一个是膳食供给,另一个是自身的内源性合成,但由于自身合成牛磺酸的一些酶活性较低,需通过外源添加牛磺酸来补充[13]。在蜜蜂的天然食物中,牛磺酸的含量为:蜂王浆20.89 mg/100 g、玉米花粉202.7 mg/100 g、荞麦花粉198.1 mg/100 g、水稻花粉56.21 mg/100 g、油菜花粉59.39 mg/100 g、油茶花粉61.34 mg/100 g、蜂蜜4.417 mg/100 g[14-17]。由此可见,蜜蜂通过食物可以获得牛磺酸,但由于其牛磺酸含量较低,需通过补饲的方式提高牛磺酸在蜂体内的水平,以达到缓解高温胁迫造成的不利影响。本试验通过在饲粮中添加牛磺酸,研究其对高温胁迫下意大利蜜蜂7日龄工蜂生理功能的影响,以期缓解蜜蜂遭受高温症状,提高蜜蜂寿命,为提高养蜂效益和蜜蜂福利提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验用牛磺酸纯度为99%,购自上海某生化科技有限公司。

1.2 试验动物

试验用意大利蜜蜂工蜂取自山东农业大学试验蜂群。选取蜂群群势、封盖子数、子脾数和蜂王产卵力相当的试验蜂群15群,巢内粉蜜贮存充足。试验开展时间为2022年8月,外界气候晴暖、无蜜粉源。

1.3 试验饲粮

配制添加不同水平(0、0.2%和0.4%)牛磺酸的3种试验饲粮,其组成见表1。

表1 试验饲粮组成

1.4 试验设计及饲养管理

从上述蜂群中随机抓取1日龄意大利蜜蜂工蜂1 500只,放置在20 cm×15 cm×10 cm的饲喂盒中,随机分为3组,每组5个重复,每个重复(每盒)100只,置于恒温恒湿的培养箱(34 ℃,相对湿度为70%),对照组饲喂未添加牛磺酸的试验饲粮(50%糖水),2个试验组则分别饲喂添加了0.2%和0.4%牛磺酸的试验饲粮,饲喂至7日龄时模拟高温环境(42 ℃,相对湿度为70%)进行高温胁迫。试验期间对蜜蜂存活状况进行监测,每天固定时间更换饲粮,用镊子将已死亡的蜜蜂移除,直至试验结束。试验所用蜂盒及培养箱需提前擦拭干净、酒精消毒、紫外照射24 h灭菌,保持整个试验过程中的饲养环境,避免人为或环境因素等产生不必要的误差。统计高温胁迫离群工蜂的存活天数、采食量、体重、体成分、血淋巴生化指标、蜂体免疫和抗氧化指标的测定,并观察中肠发育情况。

1.5 测定指标及相关方法

1.5.1 离群工蜂寿命的测定

高温胁迫24 h后,每组随机选取3个重复的工蜂继续进行高温胁迫(42 ℃,相对湿度为70%),直至全部死亡。根据各组工蜂存活天数,计算每组工蜂的平均寿命。

1.5.2 离群工蜂采食量的测定

固定每盒蜂的糖水饲喂量(16孔×200 μL),每日称量剩余糖水重并记录,每组5个重复,计算工蜂1～7日龄的采食量,计算公式为:

采食量=(全部糖水-剩余糖水)/工蜂个数。

1.5.3 离群工蜂1和7日龄体重的测定

1日龄体重:试验开始时从每组的每个重复随机选取10只工蜂,用电子天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司,FA2104,精确至0.000 1 g)称重,计算10只工蜂的平均体重并记录。

7日龄体重:高温胁迫前从每组的每个重复随机选取10只7日龄工蜂,用上述电子天平(精确至0.000 1 g)称重,计算10只工蜂的平均体重并记录为7日龄体重。

1.5.4 离群工蜂体成分的测定

高温胁迫24 h后,每个重复取10只工蜂,用镊子去除蜜蜂的整个肠道和蜜囊后,将蜂体置于已称重的称量瓶于105 ℃烘箱中烘至恒重,并用电子天平(精确至0.000 1 g)记录蜜蜂放入烘箱前的鲜重与烘后的干重,计算干物质含量[干物质含量=(鲜重-烘后的干重)/鲜重];粗蛋白质和粗脂肪含量的测定见参考文献[18]中的方法。

1.5.5 离群工蜂血淋巴生化指标的测定

高温胁迫24 h后,每个重复取50只工蜂,将1.5 mL离心管中加入少量的苯基硫脲,放置在预先制冷(0 ℃)的金属浴中。选用20 μL规格的毛细血管吸取高温胁迫24 h的工蜂胸部的血淋巴200 μL,用洗耳球将血淋巴吹入离心管中,采集完立即将样品放入-80 ℃冰箱保存。检测前,将血淋巴样品置于4 ℃冰箱内解冻后,用4 ℃离心机12 000×g离心5 min,采用全自动生化分析仪(Roche Diagnostic System Inc.,美国)测定血淋巴中总胆固醇(TCHO)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、甘油三酯(TG)、葡萄糖(GLU)、高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)的含量。

1.5.6 离群工蜂蜂体免疫和抗氧化指标的测定

每个重复取2只高温胁迫24 h的工蜂(去直肠),用1×磷酸盐缓冲液(PBS)按照质量体积比1∶9进行组织匀浆,然后用冷冻离心机3 000×g4 ℃离心10 min,取上清液,采用美联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(上海酶联生物科技有限公司)测定工蜂蜂体的酸性磷酸酶(ACP)、酚氧化酶(PO)、溶菌酶(LZM)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性。仪器操作及试剂盒使用均按照说明书的方法进行。组织匀浆上清液中蛋白质浓度用BCA蛋白定量试剂盒(江苏康为世纪生物科技股份有限公司)测定。

1.5.7 离群工蜂中肠形态学观察

每个重复取5只高温胁迫24 h的工蜂,取中肠,置于4%多聚甲醛溶液内固定,脱水后进行包埋、切片,将切片进行苏木精-伊红(HE)染色,光学显微镜下进行中肠形态学观察,拍照并测量肠壁厚度。

1.6 数据处理与分析

所有数据均以“平均值±标准差”形式表示,采用SPSS 24.0统计软件的单因素方差分析(one-way ANOVA)和Turkey’s检验进行比较分析,设定P<0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 饲粮中添加牛磺酸对高温胁迫意大利蜜蜂工蜂寿命的影响

由表2可知,与对照组相比,饲粮中添加0.2%的牛磺酸时工蜂的平均寿命提高了36.84%(P<0.05),饲粮中添加0.4%的牛磺酸时工蜂的平均寿命提高了17.58%(P<0.05),以饲喂添加0.2%牛磺酸饲粮的工蜂的寿命最长。

表2 饲粮中添加牛磺酸对高温胁迫意大利蜜蜂工蜂寿命的影响

2.2 饲粮中添加牛磺酸对意大利蜜蜂工蜂采食量的影响

由表3可知,与对照组相比,饲粮中添加0.2%的牛磺酸时1～7日龄工蜂的采食量提高了11.23%(P<0.05),饲粮中添加0.4%的牛磺酸时1～7日龄工蜂的采食量提高了17.98%(P<0.05)。以饲粮中添加0.4%牛磺酸时1～7日龄工蜂的采食量最大,说明添加0.4%牛磺酸对于提高夏季处于高温胁迫状态的离群工蜂的采食量效果最好。

表3 饲粮中添加牛磺酸对意大利蜜蜂工蜂采食量的影响

2.3 饲粮中添加牛磺酸对意大利蜜蜂工蜂体重的影响

由表4可知,各组工蜂的1日龄体重无显著差异(P>0.05);饲喂添加0.2%牛磺酸饲粮的7日龄工蜂的体重较对照组提高了6.67%(P<0.05),说明饲粮中添加牛磺酸能够有效提高夏季处于高温胁迫状态的工蜂的体重。

表4 饲粮中添加牛磺酸对意大利蜜蜂工蜂体重的影响

2.4 饲粮中添加牛磺酸对高温胁迫24 h意大利蜜蜂工蜂体成分的影响

由表5可知,在高温胁迫24 h下,饲粮中添加0.2%和0.4%的牛磺酸时工蜂的干物质含量与对照组无显著差异(P>0.05);饲粮中添加0.4%的牛磺酸时工蜂的粗蛋白质含量显著高于对照组(P<0.05);饲粮中添加0.2%的牛磺酸时工蜂的粗脂肪含量显著高于对照组(P<0.05)。

表5 饲粮中添加牛磺酸对高温胁迫24 h意大利蜜蜂工蜂体成分的影响

2.5 饲粮中添加牛磺酸对高温胁迫24 h意大利蜜蜂工蜂血淋巴生化指标的影响

由表6可知,在高温胁迫24 h下,与对照组相比,饲粮中添加0.2%和0.4%的牛磺酸均显著降低了血淋巴中TCHO和TG含量(P<0.05),显著增加了血淋巴中TP、ALB和HDL含量(P<0.05);并且,0.2%牛磺酸组血淋巴中TCHO和TP含量显著高于0.4%牛磺酸组(P<0.05),血淋巴中HDL含量显著低于0.4%牛磺酸组(P<0.05);工蜂血淋巴中GLU和LDL含量各组间没有显著差异(P>0.05)。

表6 饲料中添加牛磺酸对高温胁迫24 h意大利蜜蜂工蜂血淋巴生化指标的影响

2.6 饲粮中添加牛磺酸对高温胁迫24 h意大利蜜蜂工蜂蜂体免疫和抗氧化指标的影响

由表7可知,在高温胁迫24 h下,与对照组相比,饲粮中添加0.2%和0.4%的牛磺酸均显著提高了工蜂蜂体的ACP、LZM、SOD和POD活性(P<0.05);0.4%牛磺酸组工蜂蜂体的ACP、PO和POD活性显著高于0.2%牛磺酸组(P<0.05),但LZM和SOD活性2组间无显著差异(P>0.05)。

表7 饲粮中添加牛磺酸对高温胁迫24 h意大利蜜蜂工蜂蜂体免疫和抗氧化指标的影响

2.7 饲粮中添加牛磺酸对高温胁迫24 h意大利蜜蜂工蜂中肠形态的影响

图1为光学显微镜下20倍观察到的7日龄意大利蜜蜂工蜂的中肠形态,添加牛磺酸的组肠壁发育完整。对中肠肠壁厚度进行测量及统计学分析发现,0.2%牛磺酸组和0.4%牛磺酸组工蜂中肠肠壁厚度均显著高于对照组(P<0.05,表8)。

3 讨 论

3.1 饲粮中添加牛磺酸对高温胁迫下7日龄意大利蜜蜂工蜂生长发育的影响

蜜蜂养殖生产过程中,环境温度的变化直接影响蜜蜂的个体发育、群体活动、蜂群繁殖、群势强弱等方面,蜂群温度是对蜜蜂生命活动影响最大的环境因素[19]。蜜蜂遭受高温胁迫使蜂群情绪异常、行为错乱、生理节律紊乱,甚至死亡。早在2006年,研究人员就指出全球正面临“蜜蜂危机”,全世界的蜜蜂正在以超高的速度死亡。2004年美国在发表蜜蜂基因组序列的评论中称“如果没有蜜蜂,整个生态系统将会崩溃”[20]。因此,本研究通过在饲粮中添加牛磺酸来探究其对高温胁迫蜜蜂生长发育的影响,以期能缓解蜜蜂高温胁迫。本研究结果显示,在高温条件下,在饲粮中添加0.2%或0.4%的牛磺酸显著增加了7日龄意大利蜜蜂工蜂的平均寿命,其中添加0.2%牛磺酸时工蜂的存活时间最长,说明牛磺酸可以提高7日龄意大利蜜蜂工蜂在高温胁迫下的耐受能力,增加了生存时间,提高了寿命。

A:对照组 control group;B:0.2%牛磺酸组 0.2% taurine group;C:0.4%牛磺酸组 0.4% taurine group。

有研究表明,牛磺酸可以直接刺激动物食欲,在哺乳期母猪饲粮中添加0.1%的牛磺酸能够显著提高母猪的采食量,减少背膘损失,提高仔猪断奶重和成活率[21]。据报道,补充牛磺酸可以提高肉鸡在慢性热应激下的体增重[22]。本研究通过测定意大利蜜蜂工蜂的采食量,得出饲粮添加0.2%和0.4%的牛磺酸时工蜂的采食量较对照组显著增加,且添加0.2%的牛磺酸时工蜂7日龄体重显著高于对照组,表明添加0.2%牛磺酸能够有效地提高7日龄意大利蜜蜂工蜂的体重,而添加0.4%牛磺酸时工蜂7日龄体重与对照组无显著差异,推测高剂量的牛磺酸可能无法提高蜜蜂体重,该现象在其他物种上已被发现[23-25]。此外,添加适量牛磺酸可以增加工蜂的粗蛋白质和粗脂肪含量,有利于工蜂生长发育。

表8 饲粮中添加牛磺酸对高温胁迫24 h意大利蜜蜂工蜂中肠肠壁厚度的影响

有研究表明,在小鼠肠道缺血再灌注的情况下,添加牛磺酸可以防止肠道黏膜上皮的损伤,修复肠道上皮黏膜损伤,抑制肠道上皮细胞凋亡[26];添加牛磺酸能够增加大鼠肠道黏膜重量,使肠道细胞代谢增强,从组织学上看,添加牛磺酸后增加了空肠和回肠绒毛高度,表明肠道的吸收表面积增大,而这与细胞质量增加密切相关[27];补充牛磺酸可缓解脂多糖引起的肉仔鸡十二指肠促凋亡蛋白表达增加和抗凋亡蛋白表达减少,提高十二指肠SOD活性,降低丙二醛(MDA)含量,增强十二指肠抗氧化状态,改善肠道炎症[28]。本研究结果发现,在饲粮中添加0.2%或0.4%的牛磺酸显著增加了高温胁迫下7日龄意大利蜜蜂工蜂中肠肠壁厚度,说明添加牛磺酸可以促进蜜蜂肠道发育。

3.2 饲粮中添加牛磺酸对高温胁迫下7日龄意大利蜜蜂工蜂血淋巴生化指标的影响

研究发现,饲粮中添加0.15%的牛磺酸饲喂育成期蛋鸭42 d,可显著提高血清中TP和ALB含量[29];牛磺酸显著降低了肉鸡血清TCHO、TG、游离脂肪酸(FFA)含量,并提高了粗脂肪消化率,增加了胰腺和小肠脂肪酶活性[30];此外,牛磺酸还可显著增加慢性热应激肉鸡胸肉和皮下腹部脂肪的脂肪酶活性,显著提高血清FFA含量[30]。在高温胁迫24 h下,饲粮中添加0.2%或0.4%的牛磺酸显著降低了7日龄意大利蜜蜂工蜂血淋巴中TCHO和TG含量,显著增加了血淋巴中TP、ALB和HDL含量,且0.2%牛磺酸组血淋巴中TCHO和TP含量显著高于0.4%牛磺酸组,血淋巴中HDL含量显著低于0.4%牛磺酸组,说明牛磺酸能提高蛋白质利用率,有利于高温胁迫下7日龄意大利蜜蜂工蜂的生长发育。

3.3 饲粮中添加牛磺酸对高温胁迫下7日龄意大利蜜蜂工蜂免疫和抗氧化能力的影响

牛磺酸具有抗氧化和免疫作用,可促进钙稳态并显示出很强的抗氧化特性[31],并对砷诱导的心脏氧化应激具有保护作用[32]。饲喂添加1.25%牛磺酸的饲料可以显著提高黄鳍鳃肝脏总抗氧化能力(T-AOC)和抗氧化酶活性,同时显著降低其肝脏MDA含量[33]。饲料中添加适量的牛磺酸可以显著提高草鱼肝脏SOD、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和过氧化氢酶(CAT)活性,证明牛磺酸积极参与对氧化应激的防御[34]。在高温胁迫24 h下,饲粮中添加0.2%或0.4%的牛磺酸显著提高了高温胁迫下7日龄意大利蜜蜂工蜂蜂体的ACP、LZM、SOD和POD活性;添加0.2%牛磺酸显著提高了蜂体的LZM活性;添加0.4%牛磺酸显著提高了蜂体的ACP、PO和POD活性。上述结果表明饲粮中添加牛磺酸可提高高温胁迫下7日龄意大利蜜蜂工蜂免疫和抗氧化能力,其中0.4%牛磺酸组蜂体的ACP、PO和POD活性显著高于0.2%牛磺酸组,但该组工蜂的寿命却不及0.2%牛磺酸组,推测牛磺酸可能存在剂量效应,高剂量会导致死亡率升高[35-36]。因此,适量添加牛磺酸能更好地发挥其抗高温胁迫作用,其适宜添加剂量还有待进一步研究。

4 结 论

饲粮中添加牛磺酸显著提高了高温胁迫下7日龄意大利蜜蜂工蜂的寿命,提高了蜂体粗蛋白质和粗脂肪含量,增强了工蜂的免疫和抗氧化能力,表明饲粮中添加牛磺酸可以提高7日龄意大利蜜蜂工蜂在高温胁迫下的耐受能力。