刘公言 闫先峰 吴志强 张 印 张云海 张雅佳 周贝贝 任启峰 孙海涛*

(1.山东省农业科学院畜牧兽医研究所,山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室,农业农村部畜禽生物组学重点实验室,济南 250100;2.山东省畜牧总站,济南 250100;3.平邑县畜牧发展促进中心,平邑 273300)

消化道疾病是家兔最为多发的疾病之一,仔兔腹泻是困扰家兔生产的一个重大问题,尤其是在断奶阶段[1-2]。抗生素曾被广泛用于预防和治疗动物消化道疾病,这不仅导致养殖成本增加,而且会影响产品质量。随着人们对环境保护及食品安全的关注,抗生素作为生长促进剂在畜禽养殖中所造成的副作用日益增加。我国也于2020年全面禁止在饲料中添加抗生素,因此,抗生素替代物的开发利用成为当务之急[3]。益生菌、酶制剂和植物提取物具有绿色、安全、生态等突出优点,成为新型饲料添加剂的首选。益生菌能够调节动物肠道菌群平衡,发挥预防及治疗疾病的功效。饲粮中添加丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)等益生菌能够改善猪、家兔、鲈鱼等动物肠道菌群组成,提高机体抗氧化能力和免疫功能,对维持肠道健康具有重要意义[4-6]。葡萄糖氧化酶(glucose oxidase)是一种有氧脱氢酶,能够催化β-D-葡萄糖氧化为葡萄糖酸和过氧化氢。Wang等[7]研究表明,饲粮中单独添加葡萄糖氧化酶及分解淀粉芽孢杆菌SC06与葡萄糖氧化酶配合使用可提高肉鸡抗氧化能力和免疫功能,改善肠道菌群组成,且分解淀粉芽孢杆菌SC06与葡萄糖氧化酶配合使用的效果优于单独添加葡萄糖氧化酶。迷迭香(RosmarinusofficinalisL.)提取物作为一种重要的植物提取物,具有多种药理和生物活性。饲粮中添加迷迭香提取物可以改善断奶仔猪的生长性能、营养物质消化率、抗氧化能力、肠道形态和微生物区系,适宜添加剂量为200 mg/kg[8]。此外,迷迭香提取物作为肉兔饲料添加剂能够降低兔肉中胆固醇含量,增加肌肉营养价值,提高肌肉抗氧化能力[9]。Yadollahi等[10]研究了饲料中添加维生素E、益生菌、虾青素或迷迭香提取物对虹鳟鱼生长性能、血液学指标、抗氧化和肝脏酶活性的影响,结果表明饲料中添加维生素E(50 μg/kg)复配迷迭香提取物(50 mg/kg)或杆菌益生菌(500 mg/kg)可以有效地维持虹鳟鱼的健康状况。本试验在前期开展的丁酸梭菌、迷迭香提取物等单品的试验结果[5,9]基础上,探讨饲粮中添加丁酸梭菌、葡萄糖氧化酶和迷迭香提取物组方对肉兔生长性能、屠宰性能、免疫功能和盲肠微生物区系的影响,为家兔新型、绿色、安全的替抗产品研发提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验设计

试验选用28日龄断奶的体重相近、健康状况良好的商品伊拉肉兔500只(公母各占1/2),随机分为5组,每组10个重复,每个重复10只。对照组(Ⅰ组)饲喂基础饲粮,根据前期丁酸梭菌、迷迭香提取物等单品的试验结果[5,9],试验组分别饲喂添加100 g/t丁酸梭菌+1 kg/t迷迭香提取物(Ⅱ组)、100 g/t丁酸梭菌+100 g/t葡萄糖氧化酶(Ⅲ组)、1 kg/t迷迭香提取物+100 g/t葡萄糖氧化酶(Ⅳ组)及100 g/t丁酸梭菌+1 kg/t迷迭香提取物+100 g/t葡萄糖氧化酶(Ⅴ组)的试验饲粮。饲粮营养水平参考《肉兔营养需要量》(NY/T 4049—2021)[11],基础饲粮组成及营养水平见表1。经7 d预试期后进入30 d正试期。

1.2 样品采集与制备

试验结束当天,每个重复选取1只与该重复平均体重相近的家兔屠宰,用于统计屠宰性能;同时采集十二指肠、空肠、回肠黏膜和盲肠内容物样品,用于十二指肠抗氧化指标、空肠组织形态结构、回肠黏膜免疫指标和盲肠微生物区系测定。

1.3 测定指标和方法

1.3.1 生长性能

在试验正式开始(35日龄)和结束当日(65日龄),称量每个重复家兔重量,统计试验期间每个重复采食量,计算平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G)比。以重复为单位,计算试验期间家兔腹泻率和成活率[6]。

1.3.2 屠宰性能

试验兔屠宰前称重,记录宰前活体重,屠宰后依次对欧洲胴体重、半净膛胴体重和全净膛胴体重以及心脏、肝脏和肾脏进行称重,计算欧洲屠宰率、半净膛屠宰率、全净膛屠宰率以及心脏、肝脏和肾脏相对重量[12]。

1.3.3 十二指肠抗氧化指标

十二指肠谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性和丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量及总抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)使用南京建成生物工程研究所的试剂盒测定(货号分别为:A005、A001-1、A003-1和A015)。

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)

1.3.4 空肠组织形态结构

采集3 cm空肠样品置于4%多聚甲醛固定液固定,固定良好后进行修剪、脱水、包埋、切片、染色、封片。使用正置白光拍照显微镜(Nikon,Eclipse Ci-L)拍照,选取小肠组织的目的区域进行40倍成像,成像完成后使用Image-Pro Plus 6.0分析软件,分别测量每张切片中5处完整肠绒毛高度、绒毛宽度、隐窝宽度、黏膜层厚度和肌层厚度,取平均值,同时计算绒毛高度/隐窝深度。

1.3.5 回肠黏膜免疫指标

回肠黏膜分泌型免疫球蛋白A(secretory immunoglobulin A,sIgA)、肿瘤坏死因子-α(tumour necrosis factor-α,TNF-α)、干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)、白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2)和白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)含量使用江苏晶美生物科技有限公司酶联联免疫试剂盒测定(货号分别为:JM-00776R1、JM-00660R1、JM-00710R1、JM-00621R1和JM-00722R1)。

1.3.6 盲肠微生物区系

采集盲肠内容物样品,置于液氮保存,委托北京诺禾致源科技股份有限公司提取DNA,基于Illumina Nova测序平台测序,构建PCR-free文库,然后进行双末端(paired-end)测序,检测微生物区系多样性。

1.4 数据处理

采用SAS 9.4.0统计软件中的GLM程序进行数据的方差分析,采用Duncan氏法进行数据的多重比较,结果以平均值和均方根误差(root mean square error,RMSE)表示,P<0.05为差异显著。

2 结 果

2.1 丁酸梭菌、葡萄糖氧化酶和迷迭香提取物组方对肉兔生长性能的影响

由表2可知,在初始体重无显著差异(P>0.05)的情况下,饲粮中添加丁酸梭菌、葡萄糖氧化酶和迷迭香提取物组方对肉兔终末体重、平均日增重、料重比、成活率和腹泻率有显著影响(P<0.05)。其中,Ⅴ组的终末体重、平均日增重和成活率显著高于对照组(P<0.05),腹泻率显著低于对照组(P<0.05);Ⅳ组的料重比显著高于Ⅴ组(P<0.05)。饲粮中添加丁酸梭菌、葡萄糖氧化酶和迷迭香提取物组方对肉兔平均日采食量无显著影响(P>0.05)。

表2 丁酸梭菌、葡萄糖氧化酶和迷迭香提取物组方对肉兔生长性能的影响

2.2 丁酸梭菌、葡萄糖氧化酶和迷迭香提取物组方对肉兔屠宰性能的影响

由表3可知,饲粮中添加丁酸梭菌、葡萄糖氧化酶和迷迭香提取物组方对肉兔宰前活体重有显著影响差异(P<0.05)。其中,Ⅴ组的宰前活体重显著高于对照组(P<0.05)。饲粮中添加丁酸梭菌、葡萄糖氧化酶和迷迭香提取物组方对肉兔欧洲屠宰率、半净膛屠宰率和全净膛屠宰率以及心脏、肝脏和肾脏相对重量无显著影响(P>0.05)。

表3 丁酸梭菌、葡萄糖氧化酶和迷迭香提取物组方对肉兔屠宰性能的影响

2.3 丁酸梭菌、葡萄糖氧化酶和迷迭香提取物组方对肉兔十二指肠抗氧化指标的影响

由表4可知,饲粮中添加丁酸梭菌、葡萄糖氧化酶和迷迭香提取物组方对肉兔十二指肠GSH-Px活性、MDA含量和T-AOC有显著影响(P<0.05)。其中,Ⅱ组、Ⅳ组和Ⅴ组的十二指肠GSH-Px活性显著低于对照组(P<0.05),Ⅳ组和Ⅴ组的十二指肠MDA含量显著高于对照组(P<0.05),Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组和Ⅴ组的十二指肠T-AOC显著高于对照组(P<0.05)。饲粮中添加丁酸梭菌、葡萄糖氧化酶和迷迭香提取物组方对肉兔十二指肠SOD活性无显著影响(P<0.05)。

表4 丁酸梭菌、葡萄糖氧化酶和迷迭香提取物组方对肉兔十二指肠抗氧化指标的影响

2.4 丁酸梭菌、葡萄糖氧化酶和迷迭香提取物组方对肉兔空肠组织形态结构的影响

由表5可知,饲粮中添加丁酸梭菌、葡萄糖氧化酶和迷迭香提取物组方对肉兔空肠绒毛高度有显著影响(P<0.05)。其中,Ⅴ组的空肠绒毛高度显著高于对照组(P<0.05)。饲粮中添加丁酸梭菌、葡萄糖氧化酶和迷迭香提取物组方对肉兔空肠绒毛宽度、隐窝深度、黏膜层厚度、肌层厚度和绒毛高度/隐窝深度无显著影响(P>0.05)。

表5 丁酸梭菌、葡萄糖氧化酶和迷迭香提取物组方对肉兔空肠组织形态结构的影响

2.5 丁酸梭菌、葡萄糖氧化酶和迷迭香提取物组方对肉兔回肠黏膜免疫指标的影响

由表6可知,饲粮中添加丁酸梭菌、葡萄糖氧化酶和迷迭香提取物组方对肉兔回肠黏膜sIgA、TNF-α和IFN-γ含量有显著影响(P<0.05)。其中,Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组和Ⅴ组的回肠黏膜sIgA含量显著高于对照组(P<0.05),回肠黏膜IFN-γ含量显著低于对照组(P<0.05);Ⅴ组的回肠黏膜TNF-α含量显著高于其他各组(P<0.05)。饲粮中添加丁酸梭菌、葡萄糖氧化酶和迷迭香提取物组方对肉兔回肠黏膜IL-2和IL-6含量无显著影响(P>0.05)。

表6 丁酸梭菌、葡萄糖氧化酶和迷迭香提取物组方对肉兔回肠黏膜免疫指标的影响

2.6 丁酸梭菌、葡萄糖氧化酶和迷迭香提取物组方对肉兔盲肠微生物区系的影响

2.6.1 扩增子序列变体(amplicon sequence variants,ASVs)分析

为了使信息分析的结果更加准确、可靠,首先对原始数据进行拼接、过滤,得到有效数据;然后基于有效数据通过DADA2进行降噪,并过滤掉相对丰度小于5的序列,从而获得最终的ASVs,各组ASVs分布韦恩图见图1。

图1 ASVs分布韦恩图

2.6.2 α多样性指数分析

由表7可知,饲粮中添加丁酸梭菌、葡萄糖氧化酶和迷迭香提取物组方对肉兔盲肠微生物菌群ASVs数量和Chao1指数有显著影响(P<0.05)。其中,Ⅴ组的盲肠微生物菌群ASVs数量和Chao1指数显著低于Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅳ组(P<0.05)。饲粮中添加丁酸梭菌、葡萄糖氧化酶和迷迭香提取物组方对肉兔盲肠微生物菌群Shannon指数、Simpson指数和测序深度指数无显著影响(P>0.05)。

2.6.3 盲肠微生物物种丰富度分析

2.6.3.1 门水平分析

由表8可知,饲粮中添加丁酸梭菌、葡萄糖氧化酶和迷迭香提取物组方对肉兔盲肠疣微菌门(Verrucomicrobiota)和酸杆菌门(Acidobacteriota)相对丰度有显著影响(P<0.05)。其中,Ⅲ组和Ⅴ组的盲肠疣微菌门相对丰度显著高于对照组(P<0.05),Ⅲ组、Ⅳ组和Ⅴ组的盲肠酸杆菌门相对丰度显著低于对照组(P<0.05)。

2.6.3.2 属水平分析

由表9可知,饲粮中添加丁酸梭菌、葡萄糖氧化酶和迷迭香提取物组方对肉兔盲肠克曼菌属(Akkermansia)、果胶单核菌属(Monoglobus)、马赛菌属(Massilia)和疣微菌属UCG-010(Verrucomicrobium_UCG-010)相对丰度有显著影响(P<0.05)。其中,Ⅲ组和Ⅴ组的盲肠克曼菌属相对丰度显著高于对照组(P<0.05),Ⅳ组和Ⅴ组的盲肠果胶单核菌属相对丰度显著高于对照组(P<0.05),Ⅲ组、Ⅳ组和Ⅴ组的盲肠疣微菌属UCG-010相对丰度显著高于对照组(P<0.05),Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组和Ⅴ组的盲肠马赛菌属相对丰度显著低于对照组(P<0.05)。

3 讨 论

益生菌、酶制剂和植物提取物具有绿色、安全、生态等突出优点,成为新型绿色饲料添加剂的首先。丁酸梭菌能够代性产生丁酸,具有广泛的生物学功能,饲粮中添加丁酸梭菌可改善生猪、家禽和反刍动物的生长性能[13-15]。葡萄糖氧化酶作为一种需氧脱氢酶,能够氧化分解葡萄糖产生葡萄糖酸,促进动物肠道健康,提高生长性能。饲粮中添加葡萄糖氧化酶能够提高肉仔鸡生长性能、回肠表观氨基酸消化率和回肠微生物区系,且分解淀粉芽孢杆菌SC06与葡萄糖氧化酶配合使用效果优于单独添加葡萄糖氧化酶[7,16]。迷迭香提取物具有多种药理和生物活性,饲粮中添加迷迭香提取物可以改善动物的生长性能、营养物质消化率、抗氧化能力和免疫功能[8-10]。本研究发现,饲粮中添加丁酸梭菌、葡萄糖氧化酶和迷迭香提取物组方能够提高肉兔生长性能,降低腹泻率,这与前人研究报道基本一致。

表7 丁酸梭菌、葡萄糖氧化酶和迷迭香提取物组方对肉兔盲肠微生物α多样性指数的影响

表8 丁酸梭菌、葡萄糖氧化酶和迷迭香提取物组方对肉兔盲肠菌群门水平的影响(前10位)

表9 丁酸梭菌、葡萄糖氧化酶和迷迭香提取物组方对肉兔盲肠菌群属水平的影响(前20位)

续表9项目Items组别 GroupsⅠ(对照 Control)ⅡⅢⅣⅤ均方根误差 RMSEP值P-value梭菌属vadinBB60群 Clostridium_vadinBB60_group1 921.12 254.42 477.32 505.5820.91 377.491 00.110 9马赛菌属Massilia1 269.5a111.1b66.1b71.9b0.0b794.456 30.012 7V9D2013群 V9D2013_group968.31 370.31 265.61 774.11 445.1962.882 30.573 8瘤胃球菌属 Ruminococcus1 944.11 964.11 773.12 533.81 971.0809.376 90.409 6NK4A214群 NK4A214_group853.01 106.91 202.01 296.11 615.5689.683 70.287 9瘤胃球菌科Ruminococcaceae964.4838.9906.8651.6923.6767.129 70.932 7优杆菌属西雷姆群 Eubacterium_siraeum_group1 142.91 815.51 597.61 649.41 436.8571.375 00.199 7青枯菌属 Ralstonia10.53.6166.9326.14.4425.219 00.478 4克里斯滕森菌科R-7群 Christensenellaceae_R-7_group649.4692.6691.8760.4632.0475.502 20.985 8疣微菌属UCG-010 Verrucomicrobium_UCG-010544.9b767.0ab1 024.0a1 030.0a1 011.9a373.533 20.048 8WPS-2454.8141.079.380.80.0320.059 00.064 6甲烷芽孢杆菌属 Methanobrevibacter23.8168.8607.8398.578.8434.465 30.059 3芽孢杆菌属 Bacillus443.4107.9192.8262.40.0413.886 30.287 7考拉杆菌属 Phascolarctobacterium106.8354.141.0121.131.9288.964 70.186 6理研菌科RC9肠道群Rikenellaceae_RC9_gut_group390.8216.6260.8513.537.1459.145 80.314 3鞘氨醇单胞菌属 Sphingomonas359.9191.568.446.50.0262.990 20.065 4

丁酸梭菌具有抑制肠道致病菌侵入的功能,在维持动物肠道健康方面发挥重要调节作用[17-20]。此外,Huang等[21]研究报道,在家兔饲粮中添加丁酸梭菌能够提高小肠肠绒毛高度和促进回肠sIgA的分泌。饲粮中添加葡萄糖氧化酶可以促进肠道屏障的完整性,对改善霉菌毒素造成肉鸡肝脏氧化应激具有一定缓解功能[22-23]。迷迭香提取物中含有较高的多酚及黄酮含量,具有较大的自由基清除活性,迷迭香提取物可能通过增加抗氧化能力减少应激对虹鳟鱼的影响[24-26]。Hadree等[27]研究报道迷迭香提取物和维生素E具有降低氧化应激和激活新西兰白兔的抗氧化保护作用。本研究发现,饲粮中添加丁酸梭菌、葡萄糖氧化酶和迷迭香提取物组方对能够提高肉兔小肠绒毛高度、抗氧化能力和sIgA含量,对维持肠道健康具有重要作用。

家兔盲肠内富含大量微生物,在营养物质消化、吸收、代谢和肠黏膜免疫调节中发挥重要作用,饲粮营养物质含量和种类是影响笼养家兔盲肠微生物区系组成的重要因素[28-30]。在门水平上,家兔盲肠内容物相对丰度最大是厚壁菌门,其次是拟杆菌门,厚壁菌门与碳水化合物和蛋白质的吸收有关,拟杆菌门主要是促进碳水化合物发酵、吸收和降解多糖,这两大菌门的稳定对促进肉兔肠道健康十分重要[31-32]。大量研究表明,丁酸梭菌可通过增加牛、猪、鸭等动物肠道微生物菌群多样性,增强肠道屏障功能和免疫系统[33-35]。此外,饲粮中添加250 U/kg葡萄糖氧化酶也可以提高肉仔鸡第22～42天的生长性能,这与肠道形态、短链脂肪酸组成和回肠微生物组成的改变有关[16]。本研究发现,饲粮中添加丁酸梭菌、葡萄糖氧化酶和迷迭香提取物组方能够影响肉兔盲肠微生物菌群中疣微菌门和酸杆菌门相对丰度,影响肉兔盲肠微生物菌群中克曼菌属、果胶单核菌属、马赛菌属和疣微菌属UCG-010相对丰度。然而,目前家兔盲肠微生物菌属的变化与生长性能的关系尚不清楚。因此,需要更多的研究来理解家兔生长性能和盲肠内各种微生物群之间的相互关系。

4 结 论

饲粮中添加丁酸梭菌、葡萄糖氧化酶和迷迭香提取物组方能够改善肉兔小肠形态结构和盲肠微生物区系,提高肠道黏膜免疫功能和机体抗氧化能力,有益于维持肠道健康,降低腹泻率,提高生长性能。