范秋丽 苟钟勇 张 赛 林厦菁 董晓丽 邓远帆 蒋宗勇 阮 栋* 蒋守群*

(1.广东省农业科学院动物科学研究所,畜禽育种国家重点实验室,农业农村部华南动物营养与饲料重点实验室,广东省畜禽育种与营养研究重点实验室,广州 510640;2.希杰(上海)商贸有限公司,上海 201107)

异亮氨酸既是畜禽生长发育的必需氨基酸之一,又是支链氨基酸中唯一兼并生糖和生酮的氨基酸[1]。异亮氨酸不仅能够促进机体合成蛋白质以及需要的激素和酶类,抑制蛋白质的分解[2-3];还可作为合成谷氨酰胺的底物参与调节氨基酸代谢和能量供应[4]。前人研究报道,异亮氨酸可加速胚胎生长发育[5],还可通过促进蛋白质的沉积和利用改善肉品质、降低氮排放[6-7],通过提高肠道消化酶活性和有益菌群丰度改善肠道健康[1],通过提高抗氧化酶活性提高机体抗氧化功能;此外,异亮氨酸还可通过改善黏膜物理屏障、增强吞噬细胞的吞噬和杀菌能力以及调节免疫因子活性等提高机体非特异性免疫功能[8]。本课题组前期在黄羽肉鸡和种母鸡上的研究表明,不同水平异亮氨酸可改善1～63日龄快大型黄羽肉鸡生长性能[9],同时还显著影响黄羽肉种鸡采食量、产蛋率和蛋品质[10]。近年,在低蛋白质饲粮中添加合成氨基酸降低饲料成本和节约蛋白质饲料资源技术的研究及应用日益受到重视,但目前国内外关于地方特色和优势品种肉鸡对异亮氨酸需要量的研究报道鲜少。为此,本试验以31～60日龄中速型黄羽肉鸡为对象,研究饲粮异亮氨酸水平对其生长性能、胴体性状、血浆生化指标、肠道氨基酸转运以及蛋白质代谢和肝脏脂质代谢相关基因表达量的影响,为科学配制中速型黄羽肉鸡饲粮提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1日龄黄羽肉鸡母鸡购自佛山新广农牧有限公司。异亮氨酸纯度≥90%,由希杰(上海)商贸有限公司提供。

1.2 试验设计

试验选用1 080只初始体重为(649.17±0.84) g的31日龄黄羽肉鸡母鸡,根据体重一致原则随机分为6个组,每组6个重复,每个重复30只鸡。各组饲粮异亮氨酸水平分别为0.58%、0.66%、0.74%、0.82%、0.90%和0.98%。试验期30 d。所有试验鸡1～30日龄饲喂相同营养水平的饲粮。

1.3 试验饲粮

试验所用饲粮主要由玉米、豆粕、小麦和花生粕等原料组成,饲粮营养水平参考各原料实测值以及《黄羽肉鸡营养需要量》(NY/T 3645—2020)标准科学配制。应用氨基酸分析仪(L-8900,Hitachi,日本)测定各组饲粮异亮氨酸实际水平分别为0.58%、0.67%、0.74%、0.83%、0.90%、0.98%,各组饲粮组成及营养水平见表1。

1.4 饲养管理

试验安排专人负责饲养。试验鸡于封闭式鸡舍地面平养,地面铺放谷壳,自由采食颗粒料,自由饮水,自然通风,保持鸡舍清洁卫生。按常规饲养操作规程饲养和常规免疫程序免疫。

续表1项目 Items饲粮异亮氨酸水平 Dietary isoleucine levels/%0.580.660.740.820.900.98营养水平 Nutrient levels2)代谢能 ME/(MJ/kg)12.6012.6012.6012.6012.6012.60粗蛋白质 CP18.0618.0718.0218.1818.2018.05钙 Ca0.810.800.780.780.780.78总磷 TP0.570.550.540.530.540.54非植酸磷 NPP0.260.260.260.260.260.26赖氨酸 Lys1.051.021.031.051.031.02蛋氨酸 Met0.410.410.410.410.410.41蛋氨酸+半胱氨酸 Met+Cys0.720.720.720.720.720.72色氨酸 Trp0.180.180.180.180.180.18苏氨酸 Thr0.740.750.750.720.730.74精氨酸 Arg1.051.031.061.061.041.03亮氨酸 Leu1.861.841.851.841.831.86缬氨酸 Val0.800.820.840.810.820.83异亮氨酸 Ile0.580.670.740.830.900.98

1.5 样品采集与制备

试验结束时,每重复选取接近平均体重的2只鸡翅静脉采集全血5 mL于含有肝素钠的抗凝管中,3 500 r/min离心10 min后取上层血浆分装于500 μL灭菌离心管,于-80 ℃保存备测血浆生化指标。采血后的试验鸡颈部放血致死,屠体、半净膛、全净膛、胸肌和腿肌等分割方法按《家禽生产性能名词术语和度量计算方法》(NY/T 823—2020)操作。剖取空肠和回肠中间部位约5 cm剪开,用生理盐水将内容物冲洗干净后滤纸吸去多余水分,分装于2 mL无核糖核酸酶(RNase)离心管中,于-80 ℃保存备测空肠和回肠氨基酸转运以及蛋白质代谢相关基因表达量。取肝脏样品分装于2 mL无RNase离心管中,于-80 ℃保存备测肝脏脂质代谢相关基因表达量。

1.6 指标测定及方法

1.6.1 生长性能

试验结束当天20:00断料供水,次日08:00以重复为单位称重,计算平均日增重、平均日采食量和料重比;记录整个试验期各组死亡鸡数量,统计死亡率。

1.6.2 胴体性状

屠宰率、半净膛率、全净膛率、胸肌率和腿肌率等的计算方法均参照《家禽生产性能名词术语和度量计算方法》(NY/T 823—2004)。

1.6.3 血浆生化指标

血浆白蛋白(ALB)、尿酸(UA)、葡萄糖(GLU)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)含量以及谷丙转氨酶(GPT)、谷草转氨酶(GOT)和肌酸激酶(CK)活性等生化指标检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所,各指标测定步骤和结果计算严格按照说明书进行。

1.6.4 肠道氨基酸转运以及蛋白质代谢和肝脏脂质代谢相关基因表达

空肠、回肠和肝脏组织RNA提取、cDNA反转录以及实时荧光定量PCR(RT-qPCR)等操作流程和条件均参考Ruan等[11]的方法。引物设计采用NCBI Primer-BLAST在线软件,内参基因选用β-肌动蛋白(β-actin),并采用2-ΔΔCt法计算所有目的基因mRNA相对表达量。引物信息见表2。

1.7 数据统计与分析

应用SAS 9.2软件中的GLM过程进行单因素方差分析,在组间差异显著的前提下进行Duncan氏多重比较、线性(linear)以及二次(quadratic)趋势分析,P<0.05为差异显著,0.05≤P<0.10为差异有显著趋势,试验结果以平均值和均值标准误(SEM)表示。

对差异显著的关键生长性能和胴体性状指标应用REG程序进行二次曲线(y=Ax2+Bx+C,y表示相应指标测定值,x表示饲粮异亮氨酸水平,A和B分别代表回归方程的二次项和一次项系数,C为方程的常数项,x0=-B/2A为饲粮异亮氨酸适宜水平)回归分析。

2 结 果

2.1 饲粮异亮氨酸水平对31～60日龄黄羽肉鸡生长性能的影响

由表3可知,黄羽肉鸡料重比随饲粮异亮氨酸水平的升高呈线性和二次变化(P<0.05),当饲粮异亮氨酸水平为0.82%时,料重比最低,显著低于其他水平(P<0.05);终末体重(P=0.086)和平均日增重(P=0.091)均随饲粮异亮氨酸水平的升高呈升高趋势。饲粮异亮氨酸水平对平均日采食量和死亡率无显著影响(P>0.05)。

表3 饲粮异亮氨酸水平对31～60日龄黄羽肉鸡生长性能的影响

2.2 饲粮异亮氨酸水平对60日龄黄羽肉鸡胴体性状的影响

由表4可知,随着饲粮异亮氨酸水平的升高,黄羽肉鸡屠宰率呈线性和二次变化(P<0.05),腹脂率呈线性降低(P<0.05),胸肌率有升高的趋势(P=0.071)。与0.58%异亮氨酸水平组相比,0.82%异亮氨酸水平组半净膛率显著升高(P<0.05),0.74%和0.82%异亮氨酸水平组全净膛率显著升高(P<0.05)。饲粮异亮氨酸水平对腿肌率无显著影响(P>0.05)。

表4 饲粮异亮氨酸水平对60日龄黄羽肉鸡胴体性状的影响

2.3 饲粮异亮氨酸水平对60日龄黄羽肉鸡血浆生化指标的影响

由表5可知,黄羽肉鸡血浆ALB和TC含量随饲粮异亮氨酸水平的升高呈线性和二次变化(P<0.05),血浆GOT活性随饲粮异亮氨酸水平的升高有降低趋势(P=0.093)。与0.58%异亮氨酸水平组相比,0.74%和0.82%异亮氨酸水平组血浆UA含量显著降低(P<0.05)。饲粮异亮氨酸水平对血浆GLU和TG含量以及血浆GPT和CK活性均无显著影响(P>0.05)。

2.4 饲粮异亮氨酸水平对60日龄黄羽肉鸡肠道氨基酸转运相关基因表达的影响

由表6可知,黄羽肉鸡空肠和回肠小肽转运载体1(PepT1)mRNA相对表达量随饲粮异亮氨酸水平的升高呈线性和二次变化(P<0.05),空肠B0系统中性氨基酸转运载体(B0AT)mRNA相对表达量随饲粮异亮氨酸水平的升高有升高趋势(P=0.071)。饲粮异亮氨酸水平对空肠兴奋性氨基酸转运载体3(EAAT3)、碱性氨基酸转运载体1(CAT1)以及回肠B0AT、EAAT3和CAT1 mRNA相对表达量均无显著影响(P>0.05)。

表6 饲粮异亮氨酸水平对60日龄黄羽肉鸡肠道氨基酸转运相关基因表达的影响

2.5 饲粮异亮氨酸水平对60日龄黄羽肉鸡肠道蛋白质代谢相关基因表达的影响

由表7可知,与0.58%异亮氨酸水平组相比,0.74%和0.82%异亮氨酸水平组黄羽肉鸡回肠20S蛋白酶体(20SP)mRNA相对表达量显著降低(P<0.05)。随着饲粮异亮氨酸水平的升高,空肠(P=0.076)和回肠(P=0.093)真核细胞翻译起始因子4E结合蛋白1(4E-BP1)以及回肠核糖体蛋白S6激酶1(S6K1)mRNA相对表达量(P=0.068)呈升高趋势。饲粮异亮氨酸水平对空肠S6K1、20SP、组织蛋白酶B(CTSB)以及回肠CTSBmRNA相对表达量均无显著影响(P>0.05)。

表7 饲粮异亮氨酸水平对60日龄黄羽肉鸡肠道蛋白质代谢相关基因表达的影响

2.6 饲粮异亮氨酸水平对60日龄黄羽肉鸡肝脏脂质代谢相关基因表达的影响

由表8可知,黄羽肉鸡肝脏3-羟基3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGCR)mRNA相对表达量随饲粮异亮氨酸水平的升高呈线性和二次变化(P<0.05),肝脏肉碱棕榈酰转移酶1(CPT1)mRNA相对表达量呈二次变化(P<0.05)。与0.58%异亮氨酸水平组相比,0.82%异亮氨酸水平组肝脏沉默信息调节因子1(SIRT1)mRNA相对表达量显著升高(P<0.05)。饲粮异亮氨酸水平对肝脏过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)mRNA相对表达量无显著影响(P>0.05)。

表8 饲粮异亮氨酸水平对60日龄黄羽肉鸡肝脏脂质代谢相关基因表达的影响

2.7 二次曲线回归分析估测饲粮异亮氨酸适宜水平

由表9可知,以料重比、屠宰率、半净膛率、全净膛率和腹脂率等差异显著的生长性能和胴体性状指标为效应指标,通过二次曲线回归方程估测,31～60日龄黄羽肉鸡母鸡饲粮异亮氨酸适宜水平分别为0.76%、0.83%、0.79%、0.81%和0.79%。

表9 二次曲线回归模型估测饲粮异亮氨酸适宜水平

3 讨 论

3.1 饲粮异亮氨酸水平对31～60日龄黄羽肉鸡生长性能和胴体性状的影响

饲粮组成以及肉鸡品种、性别和日龄等因素均影响肉鸡异亮氨酸需要量。目前,肉鸡异亮氨酸需要量研究报道主要集中在玉米-豆粕型饲粮和在白羽肉鸡方面。Corzo等[12]研究报道,玉米-豆粕型饲粮中添加0.5和1.0 g/kg的异亮氨酸可提高28～42日龄罗斯308肉公鸡体重、饲料转化率和胸肌率,同时降低腹脂率。Ma等[6]研究报道,玉米-豆粕型饲粮中添加0.13%和0.26%异亮氨酸除了提高1～42日龄科宝肉公鸡体增重和饲料转化率以及降低腹脂率外,还可提高平均日采食量。Kidd等[13]研究表明,玉米-豆粕型饲粮中添加不同水平异亮氨酸显著提高18～56日龄肉公鸡体重、饲料转化率和胴体性状,且30～56日龄肉鸡饲粮异亮氨酸适宜水平为5.5～6.6 g/kg。Hale等[14]研究报道,玉米-豆粕型饲粮0.42%～0.82%水平异亮氨酸显著影响30～42日龄爱拔益加(AA)、罗斯508和罗斯708肉母鸡体重、采食量、饲料转化率、胸肌率和腿肌率,且以生长性能和胴体性状为评价指标,通过二次曲线回归模型估测,饲粮异亮氨酸适宜水平为0.63%～0.68%。本研究结果表明,玉米-豆粕型饲粮0.58%～0.98%水平异亮氨酸虽然对31～60日龄黄羽肉鸡平均日增重、平均日采食量和腿肌率无显著影响,但显著影响料重比和腹脂率,同时显著影响屠宰率、半净膛率和全净膛率,说明适宜饲粮异亮氨酸水平可改善肉鸡生长性能和胴体品质,此结果与前人研究报道一致,同时也与罗燕红等[15]应用异亮氨酸降低肥育猪料重比、提高屠宰率的研究结果相似。本课题组前期研究黄羽肉鸡精氨酸[11]、蛋氨酸[16]、色氨酸[17]和苏氨酸[18]等氨基酸需要量均使用二次曲线回归模型进行最适需要量估测,因此,本试验以料重比、屠宰率、半净膛率、全净膛率和腹脂率等差异显著的生长性能和胴体性状指标为评价指标,通过二次回归方程估测,得出31～60日龄黄羽肉鸡母鸡饲粮异亮氨酸适宜水平为0.76%～0.83%,此结果高于《鸡饲养标准》(NY/T 33—2004)和《黄羽肉鸡营养需要量》(NY/T 3645—2020)中相同日龄阶段肉用仔鸡的需要量0.63%～0.75%和黄羽肉鸡的需要量0.67%。

3.2 饲粮异亮氨酸水平对黄羽肉鸡血浆生化指标的影响

ALB和UA可在一定程度上反映蛋白质和氨基酸在体内的代谢平衡情况,ALB含量升高,表明机体蛋白质合成和免疫反应都有所增强;UA含量降低,则表明机体对蛋白质的利用率提高[19]。低蛋白质饲粮导致机体对营养物质的摄入量增加,胰岛素敏感性降低,从而使血液GLU含量升高[20]。TG和TC含量是反映机体内脂肪代谢的关键指标,其含量降低表明体内脂代谢增强[21]。GPT、GOT和CK活性增强,表明机体存在损伤和代谢障碍[18]。Ullah等[22]研究表明,饲粮异亮氨酸水平对蛋鸡血清ALB含量无显著影响,但显著降低GLU含量。Ma等[6]研究发现,饲粮异亮氨酸水平显著降低肉鸡血清TG和TC含量,同时通过升高胰岛素含量降低血清GLU含量。本课题组林厦菁等[10]前期研究显示,饲粮异亮氨酸水平显著影响快大型黄羽肉种鸡血清TG、TC、GLU含量和CK活性。本研究结果表明,饲粮异亮氨酸水平显著影响中速型黄羽肉鸡血浆ALB、UA和TC含量,且随着饲粮异亮氨酸水平的升高,血浆ALB和TC含量呈线性和二次变化,血浆UA含量降低,此结果与前人研究结果一致,说明适宜水平的异亮氨酸可提高蛋白质沉积和脂代谢;同时,饲粮异亮氨酸水平对血浆GPT、GOT和CK活性均无显著影响,此结果与Dong等[23]和Azzam等[24]应用异亮氨酸和缬氨酸等支链氨基酸在蛋鸡上的研究结果相似,这说明在本试验条件下,饲粮异亮氨酸的补充对肉鸡机体未造成损伤。

3.3 饲粮异亮氨酸水平对黄羽肉鸡肠道氨基酸转运以及蛋白质代谢相关基因表达的影响

编码寡肽和氨基酸转运蛋白的基因在肠道的表达可揭示氨基酸的转运吸收机制,其中具有代表性的有PepT1、B0AT、EAAT3和CAT1等基因,分别在转运肠上皮细胞刷状缘膜和基底膜上的二肽、三肽、中性和阳离子氨基酸以及大型脂肪族氨基酸中发挥着重要的作用[25-26]。本课题组前期研究发现,PepT1和B0AT在肠道中的表达受饲粮色氨酸水平的影响[17]。Zhang等[27]研究报道,仔猪低蛋白质饲粮补充亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸等支链氨基酸可提高空肠PepT1、B0AT和CAT1表达水平。本研究结果表明,饲粮异亮氨酸水平显著影响黄羽肉鸡空肠和回肠PepT1 mRNA相对表达量,与前人研究结果相似,且空肠和回肠PepT1 mRNA相对表达量随饲粮异亮氨酸水平的升高呈线性和二次变化,这说明适宜水平的异亮氨酸可促进肠道内寡肽的转运。

氨基酸激活的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路是参与蛋白质合成的主要信号通路之一,mTOR激活后可磷酸化下游靶点4E-BP1和S6K1,进而启动蛋白质的翻译和合成[28]。研究报道,肉鸡肠道和肌肉中4E-BP1、S6K1基因表达水平均随饲粮亮氨酸水平的升高而显著升高,从而促进肉鸡肠道的发育和体内蛋白质的合成[29-30]。本研究结果显示,随着饲粮异亮氨酸水平的升高,黄羽肉鸡空肠和回肠4E-BP1以及回肠S6K1 mRNA相对表达量均有升高的趋势,与前人研究结果相似。溶酶体和ATP依赖的泛素/蛋白酶系统是蛋白质水解的主要途径,其中20SP和CTSB是主要的水解酶和蛋白水解核心[31]。本研究结果表明,黄羽肉鸡回肠20SPmRNA相对表达量随饲粮异亮氨酸水平的升高显著降低,此结果与Miao等[32]应用精氨酸在蛋鸡十二指肠上的研究结果相似,说明适宜水平的异亮氨酸可通过提高蛋白质合成相关基因表达和降低蛋白质水解相关基因表达提高肉鸡体内蛋白质沉积,此结果也与本研究中肉鸡血浆UA含量变化结果一致。

3.4 饲粮异亮氨酸水平对黄羽肉鸡肝脏脂质代谢相关基因表达的影响

SIRT1已被证明可参与机体脂肪代谢和抗氧化,且SIRT1的激活可通过抑制脂肪生成相关基因HMGCR和PPARγ的表达,同时提高脂肪分解相关基因CPT1的表达来缓解脂质沉积[33-34]。Ma等[6]研究发现,低蛋白质饲粮添加异亮氨酸可通过激活单磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)和Janus激酶2(JAK2)/信号转导与转录激活因子3(STAT3)信号通路降低肉鸡脂肪沉积,其中肝脏和脂肪组织PPARγ表达量降低,同时CPT1表达量升高。本研究结果表明,随着饲粮异亮氨酸水平的升高,肉鸡肝脏HMGCRmRNA相对表达量呈线性和二次变化,肝脏CPT1 mRNA相对表达量呈二次变化;此外,肝脏SIRT1 mRNA相对表达量也随饲粮异亮氨酸水平的升高而显著升高,这说明适宜水平的异亮氨酸可通过降低肝脏脂肪合成相关基因表达水平以及提高脂肪分解相关基因表达水平达到降低脂肪沉积的目的,此结果也与本研究中肉鸡血浆TC含量和腹脂率变化的趋势相对应。

4 结 论

饲粮适宜水平的异亮氨酸可改善31～60日龄黄羽肉鸡母鸡生长性能和胴体性状,同时调节肠道氨基酸转运以及蛋白质代谢和肝脏脂质代谢相关基因表达。通过二次曲线回归模型估测,肉鸡获得最佳生长性能和胴体性状的饲粮异亮氨酸适宜水平为0.76%～0.83%;其中,以料重比为主要评价指标,黄羽肉鸡母鸡饲粮异亮氨酸适宜水平为0.76%,每日需要量为735 mg。