刘海兵，徐莉莉，廖华宁，马 娜，杨 柳，耿 蓉

（安徽安科余良卿药业有限公司，安徽 合肥）

雄蚕蛾为蚕蛾科动物家蚕蛾Bombyx mori Linnaeus 雄虫全体，《名医别录》首载原蚕蛾，列为中品，《本草纲目》载用雄原蚕蛾，列于第三十九卷，现今使用的与以上记述的基本相符，但南方所用原蚕蛾为家蚕蛾的雄性成虫全体，而北方以柞蚕为主，两者虽功能相近，但是两种动物，不应混淆。雄蚕蛾咸性温，归肝、肾经，具有补肝益肾，壮阳涩精，用于阳痿，遗精，白浊，尿血，创伤，溃疡及烫伤。国内目前雄蚕蛾在浙江、陕西、山东、北京、山西等11 个省市的地方药材标准中收载，但大多标准较简单[1-4]，其质量标准尚不能更好地满足其质量控制需要，因此我们系统地研究了雄蚕蛾药材的性状、鉴别、检查、含量测定等质量控制内容，为雄蚕蛾药材的质量控制提供一定的实验依据。

1 材料与仪器

ME104 型电子分析天平，DHG-9070A 型电热鼓风干燥箱；GLT-A 型马弗炉。UV-754 型紫外一可见分光光度计；电热恒温干燥箱。硅胶G 薄层板，实验所用试药与试剂均为分析纯。

雄蚕蛾对照药材（批号111746-201306）、亮氨酸对照品（批号876-200204）、缬氨酸对照品（批号140681-200401）、丙氨酸对照品（批号0873-9802）；小牛血清白蛋白 (BSA)、考马斯亮蓝G-250 (批号220729) 。采集的雄蚕蛾样品共10 批，来自于安徽、江苏、浙江和江西等4 省8 市，均为活体鲜品。

2 方法与结果

2.1 性状

本品全体呈污白色，密被白色鳞片，体长约2 cm，翅展约4 cm。头部小，复眼1 对，黑色，半圆形。胸部有翅2 对，前翅较大，近三角形，后翅较小，近圆形，多已残缺。腹部较狭窄，末稍稍尖。质脆易碎。气微腥。具体见图1。

图1 雄蚕蛾性状图

2.2 薄层鉴别

2.2.1 薄层色谱鉴别(1)

取雄蚕蛾样品，60 ℃烘干6 h，粉碎，取粉末1 g，加乙醇20 mL，超声处理20 min，滤过，滤液置水浴上浓缩至干，残渣加乙醇2 mL 使溶解，离心5 min，取上清液作为供试品溶液。取雄蚕蛾对照药材0.5 g 同法制备对照药材溶液。另取亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸对照品，加乙醇制成每1 mL 各含1 mg 的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述三种溶液各2 μL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以正丁醇-醋酸-水（3:3:1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以0.5%茚三酮乙醇溶液，于105 ℃烘至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品和对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，各样品薄层色谱见图2。

图2 雄蚕蛾药材亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸薄层色谱鉴别

2.2.2 薄层色谱鉴别(2)

分别吸取“2.2.1”项下对照药材和供试品溶液各2 μL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以正己烷-三氯甲烷-甲醇（8:3:1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃烘至显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，各样品薄层色谱见图3。

图3 雄蚕蛾药材薄层色谱鉴别

2.3 检查

2.3.1 干燥失重

取本品60 ℃干燥6 h，按照2020 年版《中国药典》四部通则0831 干燥失重测定法测定，测定10 批样品干燥失重结果为2.07%～3.11%。

2.3.2 灰分

取本品60 ℃干燥6 h，按照2020 年版《中国药典》四部通则2302 总灰分测定法测定，测定10 批样品灰分结果为3.73%～5.19%。

2.4 浸出物

雄蚕蛾主要含脂肪酸和雄性激素，溶于稀乙醇，因此用稀乙醇作溶剂，按照2020 年版《中国药典》四部通则2201 醇溶性浸出物测定法下的冷浸法，测定10 批样品浸出物结果为10.98%～15.44%。

2.5 含量测定

2.5.1 蛋白质标准溶液的制备

取小牛血清白蛋白标准品10 mg，精密称定，置100 mL 量瓶中，加水使溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.5.2 考马斯亮蓝G-250 染色溶液的配制

精密称取考马斯亮蓝G-250 染料0.02 g，加95%乙醇10 mL 溶解，再加磷酸20 mL，加水定容至200 mL，混匀，过滤，取滤液即得。

2.5.3 标准曲线的制备

精密量取蛋白质标准溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分别置具塞试管中，加水至1 mL，摇匀，再加入考马斯亮蓝G-250 溶液5 mL，放置5 min，以第1 支试管中的溶液为空白，照紫外-可见分光光度法，在595 nm 波长处测定吸光度。以蛋白浓度为横坐标、吸光度为纵坐标制作标准曲线，得线性回归方程Y= 0.0074X+0.0079，r=0.996（n=6）。结果表明标准蛋白在浓度为10.46 μg/mL～104.6 μg/mL 范围内与吸光度呈良好的线性关系，可以用来进行蛋白质含量的测定。

2.5.4 精密度试验

精密吸取标准液0.4 mL，加水至1 mL，同“2.5.3”项下方法测定其吸光度。重复操作6 次，测定的吸光度RSD 为1.48%，结果表明仪器精密度良好。

2.5.5 重现性试验

制备雄蚕蛾药材供试品溶液，平行处理6 份，测定吸光度，计算各样品蛋白含量RSD 为1.28%，结果表明样品测定重现性良好。

2.5.6 稳定性试验

制备雄蚕蛾药材供试品溶液，按上述方法测定样品在10 min, 20 min, 30 min, 60 min，90 min，120 min 时的吸光度。测定吸光度RSD 为1.69%，结果表明样品在2 h 内测定是稳定的。

2.5.7 准确度试验

采用加样回收法，精密雄蚕蛾药材样品6 份，每份约0.1 g，精密称定，分别精密加入含量为3.3 mg/mL 的小牛血清白蛋白对照品溶液1 mL，另加入pH值为8.0 的蒸馏水1 mL，60 ℃提取30 min，制备供试品溶液，测定蛋白含量，并计算加样回收率。平均回收率为99.21%，RSD 为1.75%，结果表明本方法准确度较好。

2.5.8 样品测定

取本品，60 ℃干燥6 h，粉碎，过四号筛，于P2O5干燥器中干燥12 h。称取干燥粉末用滤纸包裹，置于索氏提取器中，加入适量石油醚（30～60 ℃），60 ℃恒温水浴回流提取约4 h，至提取液无色，取出滤纸包，挥干溶剂。称取药渣粉末约0.1 g，精密称定，置5 mL离心管中，加pH 值为8.0 的蒸馏水2 mL，称定重量。60 ℃超声提取30 min，称定重量并用pH 值为8.0 的蒸馏水补足减失的重量。静置，离心（每分钟12 000转）5 min，精密取上清液0.05 mL，照标准曲线制备项下的方法，自“各管补加双蒸水至1 mL”起，依法测定吸光度，依据标准曲线计算供试品溶液中蛋白质的含量，10 批样品蛋白质含量见表1。

表1 雄蚕蛾药材蛋白质含量测定结果(n=2)

3 讨论

蛋白质及激素类为雄蚕蛾药材的活性成分[5-7]，因此，从蛋白质含量角度对雄蚕蛾药材质量进行考察具有重要意义。鉴于此，本研究通过对10 个产地雄蚕蛾药材的蛋白质含量进行了比较分析研究，以期为中药雄蚕蛾质量标准的建立提供理论和实验依据。

由于雄蚕蛾含有较多的油脂成分，对蛋白质的含量测定有较大影响，故需对雄蚕蛾药材样品进行前处理，以充分提取可溶性蛋白质。我们分别采用石油醚（30～60 ℃）、乙醚、乙酸乙酯和无水乙醇对样品进行脱脂处理，结果发现采用石油醚脱脂处理后效果较好。比较回流和超声两种提取方式下蛋白质得率的高低。结果表明，超声方式提取的蛋白量较高。分别对提取溶剂的pH 值、料液比、提取温度和时间进行单因素考察，确定雄蚕蛾药材最佳提取条件为：采用20 倍体积的pH 值8.0 的蒸馏水，60 ℃提取30 min 时可溶性蛋白的提取率为最高。

比较2020 年版《中国药典》四部中“蛋白质含量测定”中六种方法[8]，考马斯亮蓝染色法(Bradford 法)灵敏度高，最低检测1～5 mg，测定快速、简便，染色稳定，干扰物质少。因此，本研究中首次采用该方法测定雄蚕药材中的蛋白含量。

段秀俊等[9]蚕蛾药材的质量标准提升研究中建立了雄蚕蛾性状鉴别、显微鉴别、水分、总灰分、酸不溶性灰分、薄层鉴别及含量测定等质量标准对于控制蚕蛾药材质量具有显著意义，但其总氮量的测定对蛋白质含量的测定专属性不强，17 中氨基酸含量的测定方法一般企业质控部门不具备检验条件。本研究建立的质量控制方法简单、稳定、可靠，成本可控。