广东省珠海市斗门区动物卫生监督所 孟轩 梁可昌

硝基呋喃类药物是通过影响细菌体内的氧化还原酶体系，干扰细菌正常代谢的一类广谱抗生素，曾普遍应用于水产、畜牧业养殖等行业中疾病的预防和治疗。后续学者陆续研究发现，该类药物对对人体具有致畸胎作用，可能诱发癌症等重大疾病。为此，2019 年12 月农业农村部发布的第250 号公告中将其归类为食品动物中禁止使用的药物。

硝基呋喃类常用的有4种：呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃妥因、呋喃西林。硝基呋喃类药物进入鱼体后的代谢产物分别为：3-氨基-2-恶唑烷基酮（AOZ）、5-吗啉甲基-3-氨基-2-恶唑烷基酮（AMOZ）、1-氨基-2-内酰脲（AHD）、氨基脲（SEM），由于这些代谢产物与蛋白质结合而相当稳定，所以目前主要通过检测代谢物的残留量，反映硝基呋喃类药物的残留状况。

目前检测兽药残留常见的方法主要有：高效液相色谱－串联质谱法、液相色谱法、常规理化检测法、酶联免疫法、毛细管电泳法等。本研究基于《国家标准GB31656.13-2021 食品安全国家标准水产品中硝基呋喃类代谢物多残留的测定液相色谱-串联质谱法》，结合实验室设备及当地检测需求，建立了准确、高效、快速的硝基呋喃代谢残留量检测方法。

一、材料与方法

1.主要仪器和试剂。

（1）主要仪器。Agilent1290/G6470B 高效液相色谱串联质谱联用仪(美国安捷伦公司）；KQ-500DE型台式数控超声波清洗器（东莞市科桥超声波设备有限公司）；ZZDCH-16 水浴氮吹仪（广州瑞森生物科技有限公司）；THZ 台式恒温振荡器（上海精宏实验设备有限公司）；3-18K 冷冻离心机（SIGMA）；SQP型号电子天平（赛多利斯科学仪器（北京）有限公司）；IKAVORTEX3s025 涡旋器。

（2）材料与试剂。

①试验样品：皖鱼（直接采样于鱼塘）。

②试剂：甲醇（色谱纯、德国默克）；乙酸乙酯（色谱纯、德国默克）；5 摩尔/升乙酸铵（switzerland）；甲酸（赛默飞世尔科技（中国）有限公司）；二甲基亚砜（分析纯，天津市富宇精细化工有限公司）；2-硝基苯甲醛（上海麦克林）；无水磷酸氢二钾（分析纯，福晨（天津）化学试剂有限公司）；盐酸（优级纯，上海润捷化学试剂有限公司）；4 种硝基呋喃代谢物标准品（AMOZ、AOZ、AHD.HCL、SEM.HCL）以及4 种硝基呋喃代谢物同位素内标：AHD-13C3、AMOZ-D5；SEM.HCL-13C,15N2、、AOZ-D4 均 购 于德国Dr.Ehrenstorfer 公司。

2.仪器条件。

（1）色谱条件。流动相A 为甲醇，流动相B为5 毫摩尔/升乙酸铵+0.1%甲酸水溶液，色谱柱为InfinityLabPoroshell120EC-C18(3.0×100mm2.7-Micron），柱温：40℃；流速：0.4 毫升/分钟；进样量：5 微升，梯度洗脱程序见表1，后运行平衡1.5 分钟。

表1 液相色谱梯度洗脱程序

（2）质谱条件。离子源：AJSESI；正离子模式，MRM 扫描模式；干燥气温度325℃，流速6 升/分钟，鞘气温度370℃，流速11 升/分钟，雾化器压力为45psi，毛细管电压为4000 伏。质谱采集参数见表2。

表2 动态多反应监测（MRM）质谱采集参数

3.标准系列溶液配制。

（1）分别准确称取4 种标准品和4 种同位素内标适量，甲醇溶解并定容至10 毫升棕色容量瓶中，分别配制成浓度为1.0 毫克/毫升标准储备液和同位素内标标准储备液，-18℃避光保存。

（2）分别准确量取浓度为1.0 毫克/毫升的4 种标准品储备液和4 种同位素内标储备液适量，用甲醇逐级稀释，分别配制成浓度为1.0 微克/毫升的混合标准中间液和同位素混合内标标准中间液。

（3）准确量取混合标准中间液，甲醇逐级稀释，配制成浓度为100 纳克/毫升和10 纳克/毫升的混合标准工作液，现配现用。准确量取同位素混合内标标准中间液，甲醇逐级稀释，配制成浓度为100 纳克/毫升混合内标标准工作液。

工作人员正在检测水产品中硝基呋喃类代谢物残留量

4.样品前处理。

（1）样品水解与衍生化处理。准确称取捣碎后的水产品（皖鱼）样品2 克(精确到0.01 克)于50 毫升聚丙烯离心管中,加入50 微升浓度为100 纳克/毫升混合内标标准工作液，涡旋混合1 分钟，加0.2 摩尔/升盐酸溶液5 毫升、涡旋1 分钟，加入浓度为0.05摩尔/升的2-硝基苯甲醛溶液0.15 毫升。涡旋震荡1 分钟,置于恒温振荡器中，60℃避光震荡2 小时。

（2）样品提取与净化。取出离心管冷却至室温，加入1.0 摩尔/升磷酸氢二钾溶液4.0 毫升调PH 至7.0～7.5，旋涡震荡1 分钟，加入乙酸乙酯8 毫升,涡旋振荡1 分钟，10000 转/分钟冷冻离心5 分钟，取上清液至15 毫升离心管，45℃氮气吹干，加入5%甲醇溶液1 毫升溶解残留物，以10000 转/分钟的转速离心5 分钟，取上清液过滤膜，供液相色谱-串联质谱分析。

5.标准曲线的制备。称取6 个空白基质样本，分别加入50、100、200 微升浓度为10 纳克/毫升的混合标准工作液以及50、100、200 微升浓度为100纳克/毫升的混合标准工作液，配制成浓度为0.50、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 纳克/毫升的基质标准曲线，再完全按照样品前处理过程步骤进行操作，供液相色谱-串联质谱分析测定。

二、结果与分析

1.检测标准曲线的建立。按照上述基质标准溶液的浓度进行线性回归，得到线性回归方程及相关系数见表3。硝基呋喃代谢物AMOZ、AHD、AOZ、SEM 在浓度0.5～20.0 纳克/毫升呈良好线性关系，相关系数均大于0.995。

表3 方法线性范围、标准曲线方程、相关系数

2.加标回收率及精密度。在空白鱼肉中添加0.5 微克/千克、1.0 微克/千克、5.0 微克/千克三个不同浓度水平的标准物质进行回收率试验，各浓度水平平行测定6 次，经检测发现，在0.5,1.0,5.0微克/千克添加水平下，目标分析物的加标回收率 为82.0% ～103%，相对标准偏 差（RSD） 为0.996%～4.46%（n＝6），结果见表4，其回收率和精密度水平均符合方法标准的规定。

AOZ 0.5 96 1.33 1.0 102 2.43 5.0 99.2 0.996 0.5 82 4.37 2.5 100 3.72 5.0 102 3.22 SEM

表4 加标回收率及精密度

3.方法检出限和方法定量限。本方法中AMOZ、AHD、AOZ、SEM 的检测限均为0.5 微克/千克，当添加浓度为0.5 微克/千克时，AMOZ、AHD、AOZ、SEM 的 信 噪 比 分 别 为226.12、187.73、2168.43、42.01，RS/N 均大于3。该方法的定量限均为1.0 微克/千克。当添加浓度为1.0 微克/千克时，AMOZ、AHD、AOZ、SEM 的信噪比分别为2086.16、270.18、2023.20、80.57，RS/N 均大于10，检出限和定量限均满足标准相关要求。

三、结论

硝基呋喃类药物是一类广谱抗生素，具有5-硝基本结构，通过影响细菌体内的氧化还原酶体系，干扰细菌正常代谢，本方法参照GB31656.13—2021，建立了检测水产品中硝基呋喃类代谢物的方法。本方法以乙酸乙酯为提取剂，酸性条件提升了衍生温度，缩短衍生时长，在3 个不同添加浓度水平自由度为6 的条件下平均回收率、精密度以及各测定组分在0.5～20.0 纳克/毫升范围内线性关系均满足检测要求，在针对日常抽检样品的多种鱼类进行风险评估检测筛查时，用该方法同时检测质控样品，回收率达到分析要求，结果准确可靠。本方法快速简便、灵敏度高，适合于水产品中硝基呋喃类代谢物残留检测。