韩 振,宋卫东,梁宇平,张 涛,卢昕媛,万 健

(上海市浦东新区人民医院 急诊与重症医学科,上海 201299)

脓毒症是一种由感染引起的全身炎症综合征,其中急性肺损伤(acute lung injury, ALI)是脓毒症最常见和最严重的并发症之一,死亡率居高不下［1-2]。革兰氏阴性菌的脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是ALI的重要诱导因素,可激活磷脂酰肌醇三羟基激酶/蛋白激B/核因子-κB(phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B/nuclear factorκ-B,PI3K/Akt/NF-κB)信号通路,促进多种炎性细胞因子的产生［3]。

羟基积雪草酸(madecassic acid,MA)分子式为C30H48O6,分子量为504.71,是一种在积雪草植物中发现的三萜类化合物,具有抗炎等多种药理特性［4-5]。最近的研究显示,积雪草提取物通过抑制LPS诱导的肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)的产生,其作用可能是通过抑制Akt介导的NF-κB信号通路来实现［6]。MA在ALI中的作用机制尚未见研究报道。因此我们研究了MA对LPS诱导的脓毒症小鼠发生ALI的保护作用,并探索其对Akt/NF-κB信号通路的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 实验小鼠购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司[实验动物生产许可证号:SCXK(沪)2013-0016],均为SPF级健康雄性C57BL/6小鼠,共35只,其中5只用于原代细胞制备,30只用于动物实验,均为8～12周龄,体重20～25 g。本研究的动物实验符合动物伦理学的相关要求,动物伦理批准编号为2022-D-62。

1.2 实验试剂 羟基积雪草酸(CAS号: 18449-41-7,上海阿拉丁生化科技股份有限公司);LPS(L4391,Sigma-Aldrich,美国);噻唑蓝(thiazolyl blue tetrazolium bromide,MTT,CT-MTT-1,上海炎熙生物科技有限公司);p-AKT抗体(ab38449,稀释倍数1∶1 000,英国Abcam公司);AKT抗体(ab179463,稀释倍数1∶1 000,英国Abcam公司);核因子κB的抑制蛋白(inhibitor of NF-κB,稀释倍数1∶1 000,IκB)抗体(#4814,稀释倍数1∶1 000,美国Cell Signaling Technology公司);p65抗体(#8242,稀释倍数1∶1 000,美国Cell Signaling Technology公司);GAPDH抗体(#5174,稀释倍数1∶1 000,美国Cell Signaling Technology公司);TNF-α的 ELISA试剂盒(PT512,上海碧云天生物技术有限公司);IL-6的ELISA试剂盒(PI326,上海碧云天生物技术有限公司)。

1.3 实验仪器 多功能酶标仪(multiskan FC,美国Thermo Fisher公司);倒置相差显微镜(ECLIPSE TS2,日本尼康公司);Western blot印迹成像分析仪[iBright CL 750,阿拉斯加科技(北京)有限公司];超纯水系统(Dura pro 12,上海和泰仪器有限公司);超净工作台(AirGuard 1000,上海沪净医疗器械有限公司)。

1.4 原代细胞制备 根据文献报道的方法,用C57BL/6小鼠制备原代腹腔巨噬细胞(mouse primary macrophages,MPM)并进行体外培养［7]。在37 ℃和5%CO2的恒温培养箱中,MPM细胞在含有10%FBS、100 U/mL青霉素和100 mg/mL链霉素的DMEM培养基中培养。在给予MA预处理时,将MA预先溶解在DMSO溶液中,添加到细胞中以稀释到不同浓度。

1.5 LPS诱导的脓毒症小鼠模型 C57BL/6小鼠培养在相对恒定的室温(25 ℃)和湿度(60%～80%)下,将动物置于12 h的明暗循环中,并给予标准食物和充足的水。雄性C57BL/6小鼠被随机分为3组,即对照组(n=10)、LPS组(n=10)和LPS+MA组(n=10)。将MA溶解于聚乙二醇15-羟基硬脂酸酯(注射用非离子增溶剂),终浓度为2 mg/mL,雄性C57BL/6小鼠在尾静脉注射LPS(20 mg/kg)前15 min腹腔注射MA溶液(1 mL,100 mg/kg)溶液［8]。对照组和LPS组给予相同体积的溶剂,记录之后7 d小鼠的生存和死亡情况,采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线,进行生存分析。实验结束后处死小鼠分离血清,收集肺组织标本用于后续检测。

1.6 MTT法测定细胞活力 将MPM细胞(1×105细胞/mL)接种96孔板中并过夜培养,加入用0～200 μmol/L不同浓度MA预处理细胞1 h,MTT法用于测定细胞活力,将MTT溶液加入活细胞中,并在CO2培养箱培养4 h,测量490 nm处的吸光度以确定细胞存活率。

1.7 TNF-α和IL-6的测定 根据试剂生产商的说明书［9],使用LPS(10 ng/mL)刺激MPM细胞6 h后收集细胞上清液,使用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)试剂盒测定血清或者细胞上清液中TNF-α和IL-6浓度。

1.8 Western blot检测蛋白表达 肺组织匀浆后使用RIPA裂解液进行裂解,然后使用10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,并电转移至硝化纤维素膜。室温下在pH 7.6的Tris缓冲盐水中预培养1 h,加入抗Akt、p65、IκB和三磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase,GAPDH)的特异性抗体孵育,4 ℃孵育过夜后加入辣根过氧化物酶标记的二级抗体孵育,并使用增强化学发光试剂显色、拍摄和定量分析,以p-Akt与Akt的比值计算Akt激活情况。

1.9 组织病理学 右肺上叶用4%多聚甲醛固定,石蜡包埋,然后切成5 μmol/L切片。使用苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)用于染色光学显微镜观察的切片。

2 结果

2.1 MA抑制LPS诱导的小鼠原代巨噬细胞促炎因子的分泌 MTT检测表明,0～200 μmol/L的MA预处理MPM细胞时,细胞存活率差异无统计学意义(P>0.05,图1A)。ELISA检测结果表明,与Ctrl组相比,LPS刺激后巨噬细胞分泌的TNF-α(P=0.000 4)和IL-6(P=0.000 7)显著增加;而与LPS组相比,MA(10 μmol/L)预处理显著抑制了LPS刺激的TNF-α(P=0.006)和IL-6(P=0.008)分泌(图1B、C)。

A:MTT法测定MPM细胞活力;B、C:ELISA检测MPM细胞上清液TNF-α和IL-6;***:与 Ctrl组相比,P<0.001;##:与 LPS组比较,P<0.01。图1 MA抑制LPS诱导的小鼠原代巨噬细胞TNF-α和IL-6分泌

2.2 MA对LPS诱导的脓毒症小鼠的保护作用 LPS刺激小鼠4 h后,小鼠血清中IL-6和TNF-α迅速增加(P=0.000 2、P=0.000 3);而与LPS组相比,MA的预处理有效抑制了血清中IL-6和TNF-α的产生(P=0.000 4、P=0.000 9,图2A、B)。此外,与LPS组相比,MA还显著提高了LPS刺激后小鼠的7 d存活率(P=0.008,图2C)。

A、B:ELISA法测定血清IL-6和TNF-α浓度;C:各组小鼠7 d的存活率;***:与 Ctrl组比较,P<0.001;##:与 LPS组比较,P<0.01;n=10。图2 各处理组小鼠的存活率、血清中IL-6和TNF-α的表达情况

2.3 MA对LPS诱导的脓毒症小鼠肺损伤具有保护作用 HE结果显示,与Ctrl组相比,LPS刺激组小鼠的肺肺泡壁厚度增加,肺泡数量减少,肺损伤评分显著升高(P=0.000 6)。与LPS组相比,MA的预处理抑制了LPS激发小鼠肺泡壁的肿胀,并减轻了肺泡数量的下降和肺损伤评分的升高(P=0.008,图3)。

A:各组小鼠肺组织切片HE染色,放大倍数为100倍;B:各组小鼠的肺损伤分数;***:与Ctrl组比较,P<0.001 ;##:与LPS组比较,P<0.01;n=10。图3 MA在LPS刺激小鼠中显示了对肺损伤的保护作用

2.4 MA抑制LPS诱导的Akt/NF-κB信号通路 Western blot检测结果显示,LPS刺激后显著诱导脓毒症小鼠肺组织中Akt的磷酸化、IκB的降解和p65表达增加(P=0.005、P=0.014、P=0.012);而与LPS组相比,MA预处理显著抑制了Akt的磷酸化和IκB的降解,并减少了p65的表达(P=0.023、P=0.019、P=0.011,图4)。

A:代表性蛋白条带;B:蛋白条带统计结果;**:与 Ctrl组比较,P<0.01;#:与LPS组比较,P<0.05。图4 各实验组P-Akt、P65、IκB蛋白的表达情况

3 讨论

急性炎症性疾病是全世界重症监护室病人死亡的主要原因,在临床治疗中仍然缺乏有效的治疗方法。已发现甾体和非甾体抗炎药在治疗脓毒症和ALI方面的治疗局限［10]。由于脓毒症的复杂性,临床应用的大多数治疗方法不理想［11]。因此,迫切需要找到新的、有效的脓毒症治疗方法。

治疗和预防脓毒性休克及其相关疾病的一种治疗策略是及时干预NF-κB介导的炎症反应［12]。LPS通过结合蛋白和CD14呈递给TLR4/MD2复合物,激活下游的NF-κB,然而TLR4特异性抑制剂TAK-242的临床试验未能治疗患者的严重脓毒症和相关呼吸系统疾病［13]。此外,阻断TLR可能导致严重的副作用,如过敏性Th2反应或免疫耐受［14]。另一方面,许多化合物以多种方式抑制NF-κB,显示出对肺部炎症的治疗或缓解作用。其中一些天然活性化合物如槲皮素、芦丁以及MA等,能抑制促炎信号和预防感染性休克［6,15-16]。积雪草具有良好的生物安全性,在基础研究中未发现存在明显的毒性作用［5,16],这为我们探索用于脓毒症的抗炎候选药物提供了新的思路。

促炎细胞因子TNF-α和IL-6的过度表达是急性炎症疾病初期的指标特征［17],它们能迅速启动全身炎症反应,从而刺激适应性免疫反应和细胞因子风暴［18-19]。本研究发现,使用非细胞毒性剂量的MA预处理巨噬细胞后,有效降低了LPS刺激的MPM中TNF-α和IL-6的生成,同样在小鼠脓毒症模型中也观察到类似结果。因此,本研究提示MA通过减少促炎细胞因子的表达来抑制LPS诱导的MPM和动物模型中的炎症过程。此外,本研究发现MA治疗显著增加了LPS攻击小鼠的存活率。由于LPS诱导的严重炎症反应会损伤肺组织,本研究也证实了MA(100 mg/kg腹腔注射)减少了肺泡壁肿胀,抑制了肺组织中肺泡数量的下降,展现了对急性肺损伤的保护作用。

AKT可以调控NF-κB的激活,被证明是LPS促炎信号通路中的重要信号转导分子。已有研究表明,PI3K/AKT通路的抑制在ALI小鼠模型中发挥保护作用［20],并且PI3K/AKT通路会进一步抑制NF-κB活性,从而抑制炎症反应［21]。在我们的研究中,LPS刺激后Akt的磷酸化、IκB的降解和NF-κB的表达显著增加,但MA显著抑制了LPS的这一促炎效应。本研究结果表明MA发挥抗炎保护作用的潜在机制可能与Akt/NF-κB信号通路的抑制有关。

综上所述,MA对LPS诱导的脓毒症小鼠急性肺损伤具有显著的保护作用,可能与Akt/NF-κB信号通路激活有关,提示MA具有作为治疗急性炎症性疾病的潜在价值。