林凤芳 苏海兰 郑梅霞 牛雨晴 朱雁鸣 朱育菁

摘 要：在福建省三明市明溪县博落回种植区发现疑似炭疽病病例，为明确福建三明地区博落回叶片炭疽病致病的病原菌，对采集的典型病样进行病原菌的分离，并采用形态学、分子生物学和致病性测定对病原进行鉴定。结果表明：从博落回病叶中共分离到20株菌株，所有菌株的菌落形态均一致，菌落圆形，白色，背面浅灰白色至肉桂色，分生孢子团橘红色，分生孢子为长椭圆形，单孢；ITS和TUB2基因系统发育树显示，供试的菌株和果生炭疽菌Colletotrichumfructicola均聚类在一起，置信度分别为82%和99%；致病性测定结果表明，发病叶片的症状与田间的一致，符合柯赫氏法则。通过病样发病症状、菌落形态及基因序列（ITS和TUB2）分析，发现引起三明市明溪县的博落回叶片炭疽病病原菌为果生炭疽菌C.fructicola。

关键词：博落回；病原菌；鉴定；果生炭疽菌

中图分类号：S 567.239  文献标志码：A  文章编号：0253-2301（2023）06-0022-06

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2023.06.003

Isolation and Molecular Identification of the Pathogenic Bacteriaof Leaf Anthracnose in Macleaya cordata

LIN Feng-fang， SU Hai-lan， ZHENG Mei-xia， NIU Yu-qing， ZHU Yan-ming， ZHU Yu-jing*

（Institute of Crop Sciences， Fujian Academy of Agricultural Sciences，Fuzhou， Fujian 350003， China）

Abstract： A suspected case of anthracnose was found in the planting area of Macleaya cordata in Mingxi County of Sanming City in Fujian. In order to clarify the pathogenic bacteria of leaf anthracnose of M.cordata in Sanming area of Fujian Province， the pathogenic bacteria were isolated from the collected typical diseased samples， and then the pathogens were identified by using the morphology， molecular biology and pathogenicity test. The results showed that： A total of 20 bacterial strains were isolated from the diseased leaves of Macleaya cordata， and the colony morphology of all the strains was consistent. The colony was round with white color， and the backside was light white grey to cinnamon. The conidia were orange-red， and the conidial spores were long oval and single spore. The phylogenetic tree of ITS and TUB2 genes showed that the tested bacterial strains and Colletotrichum fructicola were clustered together， and the confidence levels were 82% and 99%， respectively. The results of pathogenicity test showed that the symptoms of the diseased leaves were consistent with those in the field and conformed to Koch′s rules. Through the analysis of the disease symptoms， colony morphology and gene sequences （ITS and TUB2） of the diseased samples， the pathogenic bacteria of leaf anthracnose of M.cordata in Mingxi County of Sanming City was C.fructicola.

Key words： Macleaya cordata； Pathogenic bacteria； Identification； Colletotrichum fructicola

博落回Macleayacordata Willd.R.Br隸属于罂粟科，其主要化学成分为生物碱，具有抑菌、抗炎、抗肿瘤等多方面的药理作用［1］。博落回还可作为农作物病虫害防治绿色生物农药，以及动物饲料添加剂［2-4］。目前，国内对博落回的研究主要集中在活性成分、药理作用等方面［5］。而有关博落回病害报道较少，仅游景茂等［6］采用形态学、分子技术开展博落回根腐病致病菌的研究，发现博落回根腐病病害菌为白绢病。未见其他关于博落回病害的报道。目前在福建省三明市明溪县种植区发现有大片区域博落回叶片上长有圆形或近圆形褐色病斑，严重时可造成叶片枯死脱落，疑似炭疽病。鉴于该病害的病原尚不明确，将影响病害防控措施的制定。

炭疽菌是为害植物最常见的病原真菌，可为害植物的茎、叶、花和果等，造成农作物的叶斑病、果腐病等，严重时可导致农作物的减产，进而造成经济上的损失。2012年，根据炭疽菌属在科学和经济上的重要性，其被列入第八大植物病原真菌［7］。以往对于炭疽菌的鉴定多利用形态学特征和rDNA-ITS序列分析技术，由于有许多植物的炭疽病由多种炭疽菌复合侵染引起的［8-11］，仅利用形态学特征和rDNA-ITS序列鉴定炭疽菌的种类还是有所局限。近年来，炭疽菌分类研究的重要手段为形态学方法和多基因序列分析［12］。在运用多基因序列分析时，不同的研究者选择的基因不同。目前，鉴定炭疽菌最常用的分子标记为ITS、TUB2、ACT、GAPDH、CHS和CAL［13，8-9，14-16］。为了明确博落回炭疽病的病原菌，本研究拟对该病害进行采样和病害诊断，并对其病原菌进行形态学和分子生物学鉴定，进一步通过柯赫氏法则进行验证，旨在为该病害的有效防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 主要仪器 BAO-250A光照培养箱购自上海施都凯仪器设备有限公司；Mini-7KS离心机购自杭州佑宁仪器有限公司；BX43型光学显微镜购自日本Olympus Corporation公司；C1000s型PCR仪购自美国Bio-Rad公司；DYY-6C型电泳仪购自北京六一仪器厂；GI54D型高压灭菌锅购自美国Zealay公司。

1.1.2 主要试剂 75%酒精（山东安捷高科消毒科技有限公司）、3%次氯酸钠溶液（福建维真园医药科技有限公司）、硫酸链霉素（上海阿拉丁生化科技有限公司）、真菌基因组DNA提取试剂盒（百泰克生物科技有限公司）、2×Taq MasterMix（福州尚亚生物技术有限公司）、50×TAE电泳缓冲液（北京索莱宝科技有限公司）、1%琼脂糖凝胶（莱博润科生物技术有限公司）、马铃薯葡萄糖肉汤（北京奥博星生物技术有限责任公司）、琼脂粉（杭州铭特生物科技有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 病害采样与症状观察 2019-2021年期间，于福建省明溪县博落回不同种植区调查、记录疑似炭疽病典型症状，并采集代表性样品用于病原菌分离鉴定。

1.2.2 病原菌的分离纯化与形态学鉴定 取發病叶片的病健交接处组织约30个小块，每小块大小约5 mm×5 mm，用75%的酒精浸泡30 s，再转至1%的次氯酸钠溶液中浸泡消毒5 min，用无菌水漂洗3次，置于无菌滤纸上吸干水分。转移至含有200 μg·mL-1硫酸链霉素的PDA培养基上，28℃倒置培养2～3 d。挑取菌落边缘菌丝纯化培养，观察菌落的形态和颜色，用显微镜观察分生孢子的形态特征，测量分生孢子大小。将纯化好的菌株于-80℃甘油冷冻保存。

1.2.3 病原菌的分子鉴定 取培养7 d的菌丝按照真菌基因组DNA提取试剂盒说明书进行菌株基因组DNA提取，-20℃保存备用。采用ITS和TUB2基因进行扩增和测序

［17-19］，测序引物序列见表1。PCR反应体系（25 μL）为：2×EasyTaq PCR SuperMix 12.5 μL，引物各1 μmol·L-1，DNA模板1.5 μL，ddH2O 9 μL。（1）ITS基因的PCR扩增程序：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，共30个循环；最后72℃延伸10 min。（2）TUB2基因的PCR扩增程序：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，62℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30个循环；最后72℃延伸10 min；4℃保存。将PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后，送博尚生物公司进行测序。

将所得序列上传到NCBI数据库中进行同源性比对分析后，提交至NCBI获取登录号，并下载相关菌株序列，使用MEGA7.0软件的最大似然法（Maximum Likelihood，ML）法构建系统发育树，Bootstrap设置为

1 000。

1.2.4 病原菌致病性的测定 采用柯赫氏法则，挑选健康的叶片，用无菌注射器刺伤叶片主脉两侧部位，挑取分离纯化的菌丝接种到伤口处，每种菌株5张叶片，置于28℃恒温培养箱内保湿培养，以接无菌水的为对照，定期观察叶片的发病情况。取发病叶片重新分离，并采用形态学和分子鉴定进行分离物的再次鉴定。每个处理重复3次。

2 结果与分析

2.1 疑似病例采样与症状观察

经调查，在三明市明溪县该病害在不同种植田块的发病率为5%～10%。该疑似病例发病初期在叶片上出现褐色小斑点，随着病斑的扩大，形成圆形或近圆形黄褐色斑点，多个病斑逐渐扩大联合，形成大的斑点，最终导致叶片黄化萎蔫（图1A，B）。

2.2 疑似病原菌的分离和与形态学鉴定

通过分离纯化得到的20株菌株菌落形态和孢子形态均一致。在PDA培养基上的菌落圆形，边缘整齐呈白色，菌丝绒毛状，致密，稍厚，平板背面呈不均匀的浅灰白色至肉桂色，菌落中央产生橘红色分生孢子团（图2A、2B）。分生孢子为单孢，表面光滑，长椭圆形，两端钝圆或一端稍尖，大小16.76（14.80～18.96）μm×5.66（4.68～7.04）μm（n=30）（图2C）。根据该菌株形态特征初步鉴定为果生炭疽菌Colletotrichumfructicola。

2.3 病原菌的分子鉴定

为了进一步明确分离物的种类，选择代表性菌株FJAT-32225和FJAT-32233经ITS和TUB2基因扩增、测序比对，并在GenBank获得登录号，ITS基因序列的登录号为OR287162和OR287163，TUB2基因序列的登录号为OR338336和OR338337。在NCBI中进行BLAST同源性比对，结果显示菌株FJAT-32225和FJAT-32233的ITS和TUB2序列均与果生炭疽病菌C.fructicola相应序列同源性达99%以上。从GenBank数据库选择果生炭疽病菌及其近缘种的基因序列，与供试菌株构建系统发育树。ITS序列聚类结果表明，供试2个菌株均与果生炭疽病菌C.fructicola（登录号分别为JX010173和JX010165）处于同一分枝上，置信度为82%（图3），但与其他近缘种处于不同分枝上；TUB2序列聚类结果表明，供试2个菌株均与果生炭疽病菌C.fructicola（登录号分别为JX010409和JX010405）处于同一分枝上，置信度为99%（图4），但与其他近缘种处于不同分枝上。综上所述，供试菌株FJAT-32225和FJAT-32233均可鉴定为果生炭疽病菌C.fructicola。

2.4 病原菌致病性测定

将FJAT-32225和FJAT-32233菌株回接博落回健康叶片的发病率均为100%，且发病症状与田间症状相似，无菌水对照组不发病。重新分离回接，获得的纯培养物经分子鉴定与所接种供试菌株一致。致病性测定结果符合柯赫氏法则，证实了供试的2株果生炭疽菌C.fructicola菌株为博落回炭疽病的病原菌。

3 讨论与结论

炭疽菌是世界上危害多种植物病原菌之一，而炭疽菌的准确鉴定对后期的准确防控具有重要的实践意义［20］。目前由于炭疽菌属Colletotrichum种类多、形态简单相似度高，分类鉴定存在一定难度。王树和等［21］对河南省臭椿果生炭疽菌进行描述，菌落先白色后灰色，背面黑色，分生孢子为圆柱状，两端钝圆，单孢，无色；李河等［13］对油茶果生炭疽菌的描述，在PDA板上，菌落圆形，颜色由白色渐变为灰色到灰黑色，分生孢子团橘黄色，分生孢子椭圆形，单孢，无色；本研究从博落回发病的叶片中，获得20株炭疽菌菌落形态特征与果生炭疽菌的十分相似，因此根据形态初步鉴定这20株病原菌为果生炭疽菌C.fructicola。

目前应用形态学和多基因分析方法，在鉴定炭疽菌属真菌种类上提高了准确率。王成彬等［18］通过ITS、GAPDH、CHS-1、ACT和TUB2基因联合分析，将鸢尾白蜡树炭疽菌与形态上同其相似的白蠟树炭疽菌复合群、禾谷炭疽菌复合群和平头炭疽菌复合群中的一些种区分开来。本研究通过对供试菌株的ITS和TUB2序列进行比对，发现与果生炭疽病菌C.fructicola相应序列同源性达均达99%以上。随后通过分别构建ITS和TUB2基因系统发育树，结果均显示为供试菌株与果生炭疽病菌C.fructicola聚类于同一分支，因此可以确定这20株菌株为果生炭疽病菌C.fructicola。

本研究通过对三明明溪博落回炭疽菌病样进行病原菌的分离纯化获得的菌株进行致病性测定证明分离的菌株可侵染博落回叶片症状与田间一致，分离纯化的菌株与供试菌株一致。结合ITS和TUB2序列鉴定，明确引起博落回炭疽病的病原菌为果生炭疽菌C.fructicola。该病原菌首次在博落回中报道，但有关该病原菌在博落回上的侵染过程及防治措施有待进一步研究。

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（责任编辑：柯文辉）