李 婷 汪小玉 税丕先 石厚银 张 旗 沈骅睿△

（1.西南医科大学，四川 泸州 646000；2.四川西部医药技术转移中心，四川 成都 610041；3.西南医科大学附属中医医院，四川 泸州 646000；4.四川省合江县中医医院，四川 合江 646200）

骨肉瘤（OS）是一类原发性恶性肿瘤，好发于儿童和青少年［1］。近5 年OS 患者的生存率虽有一定提高，但转移性和复发性问题依然未得到解决。治疗OS 的经典化疗药物顺铂等也只能缩小肿瘤体积，会产生一系列不良反应［2］。因此，化疗药物的多重耐药以及尚无规范化新型治疗方式等问题，也反映了OS当前治疗策略的不足与无突破性进展的缺陷。

中医学认为OS属于正虚邪实、邪盛正衰的一类恶性骨病［3］，依据中医“肾藏精，主骨生髓”等理论［4］，应从肾论治。仙茅是石蒜科一味具有补肾助阳、益精血、强筋骨和行血消肿作用的传统中药［5］，主要含有酚及酚苷、木质素、三萜皂苷、黄酮类、挥发油及微量元素等化学成分［6-10］。已有研究表明，仙茅对人胃癌细胞、人肝癌细胞、小鼠肉瘤均有较好的抑制作用［11］；《本草求真》将仙茅与附子、补骨脂等辛温补益药物划分为一类，而已有研究证明补骨脂素能够诱导骨肉瘤MG-63细胞凋亡［12］。OS 的发病机制与多种信号通路和基因都有联系，其中MAPK 信号通路也称丝裂原活化蛋白激酶，属于丝苏氨酸蛋白激酶，能够被细胞外刺激激活［13］。众多文献资料表明，OS发生和发展所必需的靶点、途径和过程都有该信号通路的参与和调控［14］，其家族有4条途径，分别包括ERK1/2、JNK、p38 MAPK 和ERK5。JNK 参与细胞应激、分化及凋亡等过程，p38 MAPK 参与细胞因子的产生、转录、调节以及凋亡等过程［15］。因此JNK 和p38 MAPK 两个途径与细胞凋亡过程密切相关。该信号通路被异常激活后会导致OS 的发生。但目前针对仙茅黄酮的研究还较少，我们前期预实验发现仙茅总黄酮具有抑制骨肉瘤细胞增殖、诱导其凋亡的作用趋势，但并未深入研究其作用机理。因此，本研究拟以人骨肉瘤MG-63 细胞为模型，探讨仙茅总黄酮通过MAPK 信号通路及凋亡相关因子诱导其凋亡的作用，以期为开发有效治疗OS的药物提供新的方向和实验依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与药物

仙茅饮片购自成都荷花池中药材市场，经鉴定为石蒜科植物仙茅的根茎。CCK-8 试剂盒购自武汉BOSTER 公司；Hoechst 33258 染色液购自北京索莱宝公司；AnnexinV-FITC 试剂盒购自碧云天生物技术研究所；Bcl-2、Bax、Caspase-3、JNK、p38 MAPK、GAPDH抗体购自美国CST 公司；羊抗兔IgG（H+L）HRP、ECL超敏发光液购自Affinity 公司；彩色预染蛋白marker 购自赛默飞公司；DMEM 培养基、胎牛血清、青链双抗购自以色列BI公司；水为超纯水。

1.2 仪器

Synergy 2 型全波长酶标仪，购自美国Bio Tek 公司；TS2R-LS 型倒置荧光显微镜，购自日本Nikon公司；FACSCantoⅡ型流式细胞仪，购自美国BD 公司；LightCycler® 480 Ⅱ型荧光定量PCR 仪，购自瑞士Roche 公司；Gel Doc XR 型凝胶成像系统、JT300C 型垂直电泳仪，购自美国Bio-Rad 公司；Eppenderf 5424R型高速冷冻离心机，购自德国Eppenderf 公司；BPN-150CRH 型CO2培养箱，购自上海一恒科学仪器有限公司。

1.3 细胞

人骨肉瘤MG-63 细胞株（MP-0046），购自河南多沃生物科技有限公司。

1.4 研究方法

1.4.1 仙茅总黄酮药物提取纯化 按本课题组前期研究所得方法［16］制备仙茅总黄酮。取仙茅药材粉末（过4 号筛），以80%乙醇、质量体积比1∶25（mg/mL）、85 ℃加热回流提取2.5 h，提取液过滤，浓缩干燥后以AB-8型树脂进行纯化，上样浓度3 mg/mL，pH 5.0，1 mL/min上样4 BV，7 BV 的50%乙醇1 mL/min 进行洗脱，冷冻干燥后即得仙茅总黄酮，以芦丁为对照品通过NaNO2-Al（NO3）3-NaOH显色法检测并计算得出仙茅总黄酮得率为13.95 mg/g，纯度为9.28%；纯化后纯度提高至40.72%，以提高实验的准确性。

1.4.2 药物配制及细胞培养 使用前将仙茅总黄酮粉末用空白DMEM 高糖培养基溶解至总黄酮浓度为500 mg/L 的母液，过0.22 μm 滤膜除菌，备用。MG-63细胞培养于含10% 胎牛血清和1% 青-链双抗的DMEM 高糖培养基中，于37 ℃、5% CO2培养箱中常规培养。

1.4.3 CCK-8 法检测细胞增殖［17］设置不加细胞的空白组、不加药物的对照组和给药组（总黄酮质量浓度为25、50、100、200、300、400、500 mg/L），每组4 个复孔。取对数生长期的MG-63细胞，调整细胞密度为8×104/mL，每孔100 μL 均匀接种于96 孔板中，培养至完全贴壁后给药，分别培养24、48、72 h，每孔加入CCK-8试剂10 μL，37 ℃孵育30 min，置酶标仪上于450 nm处检测各孔光密度（OD）值，计算细胞存活率，用SPSS 17.0软件计算半数抑制浓度（IC50）。上述实验重复3次。

1.4.4 Hoechst 33258染色法观察细胞核凋亡形态［18］设置对照组及仙茅总黄酮低、中、高浓度组（50、100、200 mg/L），每组设3 个复孔。将对数生长期的MG-63细胞按1×104个/孔的密度接种于24 孔板，培养贴壁后分组给药。弃去旧培养基，加药培养48 h 后加入PBS洗涤细胞，加入0.5 mL 无水甲醇于4 ℃固定3 h，洗涤细胞后每孔加入0.2 mL Hoechst 33258 染色液，室温避光染色10 min，吸除Hoechst洗涤2次，加入PBS 0.5 mL，于荧光显微镜下观察各组细胞凋亡形态并拍照。

1.4.5 AnnexinV-FITC 双染法检测细胞凋亡［19］将对数生长期的MG-63 细胞以2×105个/孔的浓度接种于6孔板中，过夜完全贴壁后按“1.4.4”项下方法分组给药，48 h 后分别收集每组细胞，按照AnnexinV-FITC 细胞凋亡检测试剂盒说明书操作，采用流式细胞仪检测细胞凋亡率。上述实验重复3次。

1.4.6 Western blotting 法检测细胞MAPK 信号通路及凋亡相关蛋白表达水平［20］MG-63 细胞按“1.4.4”项下方法接种细胞、分组并给药。48 h 后提取各组总蛋白，按BCA 法测定每组蛋白浓度，将蛋白样品与上样缓冲液按4∶1 的比例混合，95 ℃变性5 min。取各组蛋白样品30 μg，依次经SDS-PAGE 电泳、转膜、封闭后，分别加入一抗（1∶1 000）4 ℃孵育过夜。TBST 清洗3次，加入二抗（1∶5 000）室温下孵育1 h，TBST 清洗3次，显影。采用Image J 软件处理图片，以GAPDH 为内参蛋白，以目标蛋白与GAPDH的灰度值比值表示目标蛋白的表达水平。每个蛋白表达做3次重复。

1.4.7 RT-PCR 法检测细胞MAPK 信号通路及凋亡相关蛋白mRNA 表达水平［21］MG-63 细胞按“1.4.4”项下方法接种细胞、分组并给药。48 h后按Trizol试剂盒方法提取各组样品总RNA，检测RNA 纯度。按逆转录试剂盒操作方法进行cDNA 合成反应。于95 ℃3 min，95 ℃10 s，60℃10 s，72℃20 s，40个循环进行RT-PCR反应，其所用引物序列见表1。每组基因重复做3 次，得到扩增曲线和CT 值，对各样本的CT 值进行分析，以2-ΔΔCT表示各组基因表达量。计算公式如下：

表1 基因与引物序列

ΔCT = CT目的基因-CTGAPDH；-ΔΔCT = ΔCT目的基因-ΔCTGAPDH；2-ΔΔCT由-ΔΔCT值进行2的幂运算得到。

本实验通过RT-PCR 方法，检测不同浓度仙茅总黄酮作用后JNK2、p38MAPK、Bax、Bcl-2 及Caspase-3的mRNA表达水平。

1.5 统计学处理

2 结 果

2.1 各组细胞增殖情况比较

见表2。由此可知，仙茅总黄酮能对MG-63 细胞产生抑制作用，并呈现出时间和浓度依赖趋势。作用24、48、72 h 后细胞的IC50分别为（273.32±2.44）、（108.35±2.04）、（78.41±1.89）mg/L。虽然药物作用72 h时细胞的IC50值最低，但与作用48 h时的IC50值差距不大，因此以48 h作为药物作用时间，以50、100、200 mg/L作为仙茅总黄酮给药的低、中、高浓度。

表2 各组细胞增殖情况比较（±s）

表2 各组细胞增殖情况比较（±s）

注：与对照组比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01，***P ＜0.001。下同。

组 别对照组仙茅总黄酮25 mg/L组仙茅总黄酮50 mg/L组仙茅总黄酮100 mg/L组仙茅总黄酮200 mg/L组仙茅总黄酮300 mg/L组仙茅总黄酮400 mg/L组仙茅总黄酮500 mg/L组n3 3 3 3 3 3 3 3 24 h 98.78±2.25 89.02±6.34*84.11±3.33**81.27±2.84**79.32±5.69**49.78±3.67**30.04±1.54**23.80±4.59**48 h 95.64±2.60 84.60±3.51**78.22±2.79**65.54±4.51**29.99±1.14**16.10±1.03**8.19±4.51**5.77±3.00**72 h 94.13±1.10 81.72±1.88**61.62±2.17**49.85±1.90**21.06±2.76**8.92±3.61**5.65±1.76**3.43±1.97**

2.2 各组细胞核凋亡形态比较

见图1。由图可知，对照组中细胞表现为完整的细胞形态，细胞核大小均一，表现为均匀的蓝色淡染；仙茅总黄酮作用后细胞随着药物剂量的升高逐渐固缩、破裂，细胞核表现出高亮的蓝色浓染，染色质逐渐固缩贴近细胞核，因凋亡而碎裂的细胞核也逐渐增多，并出现凋亡小体。因此，仙茅总黄酮作用后细胞表现出了典型的凋亡细胞细胞核荧光特征，且浓度越高，细胞凋亡现象越明显。表明仙茅总黄酮作用于MG-63细胞，可诱导其凋亡。

图1 各组细胞凋亡染色（Hoechst 33258染色，200倍）

2.3 各组细胞凋亡比较

见图2。仙茅总黄酮各组细胞加入药物作用48 h后，流式细胞仪检测结果显示，对照组及仙茅总黄酮50、100、200 mg/mL 组的细胞凋亡率分别为（5.47±1.38）%、（16.61±1.19）%、（35.82±2.76）%、（47.98±2.51）%，呈现出浓度依赖趋势，仙茅总黄酮各组与对照组比，差异均有统计学意义（P＜0.01），表明不同浓度的仙茅总黄酮均能促进MG-63细胞凋亡。

图2 各组流式细胞图

2.4 各组细胞MAPK 信号通路及凋亡相关蛋白表达水平比较

见图3，表3。与对照组相比，仙茅总黄酮作用48 h后，JNK、p38 MAPK 的表达水平在中、高浓度组细胞中显著降低，Caspase-3的表达水平显著升高；Bax的表达水平在药物低、中、高浓度组中均显著升高，Bcl-2的表达水平均显著降低。经统计学分析，以上差异均有统计学意义（P＜0.05、P＜0.01或P＜0.001）。

图3 各组细胞中JNK、p38MAPK及凋亡相关蛋白电泳条带

表3 各组细胞中蛋白相对表达量比较（±s）

表3 各组细胞中蛋白相对表达量比较（±s）

组别对照组仙茅总黄酮50 mg/L组仙茅总黄酮100 mg/L组仙茅总黄酮200 mg/L组n3 3 3 3 JNK/GAPDH 0.81±0.15 0.66±0.21 0.60±0.18*0.51±0.16**P38 MAPK/GAPDH 0.83±0.08 0.68±0.09 0.59±0.10*0.47±0.02**Caspase-3/GAPDH 0.60±0.08 0.79±0.08 0.91±0.09*1.31±0.13**Bcl-2/GAPDH 1.09±0.07 0.94±0.06*0.86±0.09*0.69±0.05**Bax/GAPDH 0.51±0.03 0.68±0.04**0.79±0.04***0.99±0.05***

2.5 各组细胞MAPK 信号通路及凋亡相关蛋白mRNA表达水平［22］

见表4。不同浓度仙茅总黄酮作用48 h 后，各基因的mRNA表达水平变化趋势与对应蛋白表达水平趋势相同，且与对照组相比，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

表4 各组基因mRNA表达量比较（±s）

表4 各组基因mRNA表达量比较（±s）

组别对照组（n=3）仙茅总黄酮50 mg/L组（n=3）仙茅总黄酮100 mg/L组（n=3）仙茅总黄酮200 mg/L组（n=3）时间ΔCT 2-ΔΔCT ΔCT 2-ΔΔCT ΔCT 2-ΔΔCT ΔCT 2-ΔΔCT p38 MAPK 8.59±0.28 1.00±0.18 8.80±0.34 0.87±0.20 9.46±0.20 0.55±0.08*9.59±0.20 0.50±0.07**JNK 2 5.54±0.17 1.00±0.11 5.94±0.06 0.76±0.03**5.95±0.04 0.75±0.02**6.16±0.05 0.65±0.02**Bcl-2 4.43±0.04 1.00±0.03 4.65±0.06 0.86±0.04*4.70±0.08 0.83±0.04**4.83±0.11 0.76±0.06***Bax 4.04±0.14 1.00±0.10 3.99±0.17 1.03±0.12 3.77±0.17 1.21±0.14 3.29±0.45 1.72±0.56*Caspase-3 4.21±0.29 1.00±0.19 4.08±0.19 1.03±0.14 3.71±0.44 1.18±0.10 3.33±0.53 1.47±0.05*

3 讨 论

OS 虽整体发病率低于其他器官组织的恶性肿瘤，但转移和复发问题非常严重，恶性程度在病理上被列为高级别。近年来，标准OS 治疗方案逐渐形成：新辅助化疗-手术-辅助化疗［22］。但仍然存在一些问题，导致OS的治疗无显著进展，进入治疗的平台期。文献资料表明，OS 发生和发展所必需的靶点、途径和过程都有MAPK 信号通路的参与和调控［23］，MAPK 信号通路中JNK 和p38 MAPK 两个途径与细胞凋亡过程密切相关。Bax 和Bcl-2 蛋白在细胞凋亡过程中分别发挥着促凋亡和抗凋亡作用。Caspase 是细胞凋亡的核心成员，Caspase-3 激活后可诱导线粒体凋亡通路的激活，诱导半胱天冬酶的切割底物多聚聚合酶PARP 的裂解，从而引起细胞凋亡［24］。

本实验在阳性培养基的基础上添加不同浓度的仙茅总黄酮对骨肉瘤MG-63 细胞进行培养。CCK-8、Hoechst 33258 染色、AnnexinV-FITC 双染实验表明不同浓度的仙茅总黄酮能对MG-63 细胞的增殖产生抑制作用，并促进MG-63 细胞凋亡，其促凋亡作用与仙茅总黄酮呈浓度依赖。进一步利用了RT-PCR 和Western blotting 检测验证了上述结果，并表明不同浓度的仙茅总黄酮能够下调MAPK 信号通路中JNK、p38MAPK 和抗凋亡因子Bcl-2 基因和蛋白的表达水平、能够上调促凋亡因子Bax、Caspase-3基因和蛋白的表达水平。

综上所述，仙茅总黄酮能抑制骨肉瘤MG-63 细胞的增殖并促进其凋亡，究其机制可能与抑制MAPK 信号通路的活性、Bcl-2蛋白的表达，促进Bax、Caspase-3蛋白的表达有关。以上研究表明仙茅作为常用的补肾助阳中药，在OS的治疗方面具有巨大的药用价值等待发掘。后期，本课题组也将结合体内实验，建立裸鼠MG-63 细胞移植瘤模型，给予仙茅总黄酮进行干预，通过体内移植瘤各项指标的检测，进一步探究仙茅总黄酮对OS 的治疗作用，并进一步证明其机理，为未来OS的治疗提供新的更完整的理论依据。