陈钰 林敏 陈雅婷 董颖 白婧 刘传斌 李泱

(1福建卫生职业技术学院,福建 福州 350101;2福建中医药大学附属人民医院;3福建医科大学省立临床医学院心内科;4解放军总医院心血管病学部)

心房颤动(房颤)是临床上比较常见的心律失常之一。房颤的预后和复发率均较高,而且存在多种并发症。在细胞水平的基础研究中,房颤的发生机制均以离子通道电流的改变为基础〔1〕。而钾离子电流是心房复极的主要电流之一,在房颤的发生和发展过程中将发生不同程度的改变,也是诱发房颤发生发展的重要电重构基础〔2〕。临床上阻滞钾离子通道的药物对于房颤的治疗起到一定作用,可能其单一阻滞离子流导致治疗效果一直不理想。为了更好地减少房颤的发生,寻找新的多种离子流共同阻滞的药物尤为必要。

大蒜素为百合科植物大蒜鳞茎中获得的一种活性成分。已有研究显示,大蒜素可以抑制心肌收缩和抗心律失常〔3〕,其可减少心肌细胞钙离子内流和钠电流〔4〕。大蒜素可通过调节多种离子通道发挥改善心律失常的作用,同时对心肌肥厚也有治疗作用〔5〕。有研究证实,对小鼠心室肌细胞钾电流大蒜素呈现出抑制效果〔6〕。大蒜素可使大鼠的心房肌细胞超速激活延迟整流钾电流发生改变,提示了对于房颤的治疗该成分可能存在一定的潜力。

转基因技术的快速发展使得小鼠被越来越多地应用于各类研究,尤其是在心律失常发病特点及机制等方面。小鼠心房肌细胞膜上存在多种亚型的钾通道,性质也较为复杂。总外向钾电流(IK,peak)、瞬时外向钾电流(Ito)和超极化激活的延迟整流钾电流(IKUr)等外向钾电流也常常混合在一起,不易分离,有效地分离各钾通道电流对于探讨其在动作电位中的贡献和药物作用十分有利。而且以往的研究主要针对单一电流发挥作用,但电流的作用往往是相互联合的,药物对多种电流的效应研究更具有药理意义。本研究采用全细胞膜片钳技术探讨大蒜素对小鼠心房肌细胞外向钾电流IK,peak、Ito和IKUr的效应及可能的作用机制,希望为治疗房颤的新药研究与开发提供更多选择。

1 材料与方法

1.1溶液与试剂 台氏液组成:氯化钠(NaCl) 135 mmol/L、氯化钾(KCl) 5.4 mmol/L、磷酸二氢钠(NaH2PO4)0.33 mmol/L,氯化钙(CaCl2)1.8 mmol/L,氯化镁(MgCl2) 1.0 mmol/L,葡萄糖10 mmol/L,4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES) 10 mmol/L,用氢氧化钠(NaOH)将pH值调节至7.3。0.2 mmol/L Ca2+的台氏液为台氏液中加入0.2 mmol/L CaCl2,无钙台氏液为台氏液中不加入CaCl2。细胞贮存液(KB液)组成:氢氧化钾(KOH) 110 mmol/L、磷酸二氢钾(KH2PO4)10 mmol/L、牛磺酸10 mmol/L、乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA) 5,KCl 25 mmol/L、草酸10 mmol/L、谷氨酸70 mmol/L、HEPES 5 mmol/L、Glucose 10 mmol/L,pH值用KOH调节到7.4。 用于钾电流记录的细胞外液组成:CaCl20.6 mmol/L、MgCl25 mmol/L,N-甲基-D-葡萄糖胺149 mmol/L,HEPES 5 mmol/L,用氯化氢(HCl)调节pH值达到7.4。用于钾电流记录的细胞内液:天冬氨酸钾85 mmol/L、KCl 45 mmol/L、三磷酸腺苷镁(MgATP) 5.0 mmol/L、丙酮酸钠5 mmol/L、EGTA 10 mmol/L、葡萄糖11 mmol/L、HEPES 10 mmol/L、用KOH调pH值至7.4。

蛋白酶E、胶原酶、CaCl2、氯化镉(CdCl2)、天门冬氨酸钾、牛血清白蛋白、丙酮酸钠、HEPES、MgATP、4-氨基吡啶(4-AP)及河豚毒(TTX)均购自Sigma公司;EGTA购于Fluka Biochemika公司,其他试剂均为分析纯。

1.2小鼠心房肌细胞分离及分组 昆明小鼠〔体质量(20±1.5)g,雌雄皆有〕购于解放军总医院动物实验中心〔合格证号:SCXK(字)2015-2018〕,腹腔注射100 IU/ml肝素,采用颈椎脱臼法将小鼠处死。开胸后迅速取出小鼠心脏并放置于无钙Tyrode中,在显微镜下操作,快速逆行插管至主动脉处,随后快速将心脏固定在灌流装置上。先用不加入钙Tyrode以2.5 ml/min速度灌流5 min,再用50 ml含有胶原酶 0.12 g(效价为280～300 U/mg)、牛血清白蛋白12.5 mg和蛋白酶E 6.0 mg的Tyrode灌流12～15 min。剪去小鼠心室部分,沿房室间沟取下心房部分,放入含有2.5 mg/ml 胶原酶的无钙Tyrode中,接着消化近5 min,用塑料滴管轻柔抽吸并吹打,分散成单个细胞后转移至预先用层黏连蛋白处理的培养皿上,保持37 ℃、5% CO2,培养至细胞贴壁。通过倒置显微镜观察,实验过程中选择表面无颗粒、边缘较整齐、无收缩的长梭形细胞,并记录其电流情况。将实验中消化分离得到的细胞分成对照组及大蒜素组。采用局部灌流装置以恒流将空白的细胞外液灌流于对照组细胞外,大蒜素组以恒流灌流方式给予30 μmol/L大蒜素。

1.3药物的应用 大蒜素(含量≥98%,CAS:539-86-6)购自上海禾风制药有限公司,呈无色或淡黄色油状物,其相对分子质量是162。临用前采用细胞外液配制成所需终浓度。

1.4心房肌细胞电流的记录 电流采用全细胞膜片钳方法记录,并确保在电压钳制模式下完成。首先将计算机与膜片钳放大器Axon-700B(Molecular Devices,Sunnyvale,CA,USA)进行连接。由软件(pCLAMP10.4)控制来采集电压输入信号和刺激信号,Digidata 1440A数模转换器(Molecular Devices,Sunnyvale,CA,USA)操作完成。玻璃微电极利用pp-83微电极拉制仪(Narishige Co.Japan)进行拉制,达到入液电阻为2.0～5.0 MΩ、尖端内径为1.0～2.0 μm为宜。将玻璃微电极慢慢接近心房肌细胞并形成高阻抗封接,当封接电阻达到1 GΩ以上时,用负压吸附脉冲法打破心房肌细胞膜最终形成全细胞记录模式。将刺激参数设置为0.4 V/s,电流则按Cm=I/(dV/dt)方程式计算(其中Cm是膜电容,dV/dt是电压斜率,I是电流值)测定细胞膜的电容。电流值均采用电流密度(pA/pF)的形式表示,以消除细胞与细胞之间造成的误差。信号的采集应用低频3 kHz和高频10 kHz进行滤波。慢电容的补偿为85%～90%以此来消除由于膜电容的充放电带来的影响。

1.5参数设置IK,peak:设置钳制电位在-40 mV,-40～+50 mV去极化刺激,给予500 ms,进而产生一个快速的激活电流。

Ito:于细胞外液加入100 μmol/L 4-AP。将钳制电位设置在-40 mV,给予一个500 ms,-40～+50 mV去极化刺激,从而将电流诱发出来。该电流可以被2 mmol/L的4-AP阻断,确定为Ito。

Ito稳态激活曲线:保持电位在-40 mV,先给予-40 mV,20 ms的预刺激,再施加予500 ms,阶跃为10 mV,从-70 mV～+50 mV系列去极化刺激后,归一化各电压下的电流,用相对电流对膜电位作图,从而得到稳态激活曲线,利用Boltzmann方程式I/Imax=1/{1 + exp〔(Vm-V1/2)/k〕}进行曲线的拟合,得出激活曲线斜率(Kact)与半激活电压(V1/2,act)。

Ito稳态失活曲线:保持电位-70 mV,施予1 000 ms,阶跃设置为5 mV,从-90 mV～+20 mV的系列去极化刺激,且在每一个条件刺激后施予一个测试刺激+50 mV,300 ms,归一化各电流幅值,用相对电流对膜电位作图,从而获得出稳态失活曲线,利用Boltzmann方程式I/Imax=1/{1+exp〔-(Vm-V1/2)/k〕}拟合曲线,获得半失活电压(V1/2,inact)与失活曲线斜率(kinact)。

Ito关闭态失活时间常数:设定钳制电位在-110 mV,给加+50 mV,300 ms的条件刺激,恢复至-110 mV,再于-65 mV,5、10、25、50、100、200、400、800和1 600 ms不同时间间隔后,给予一个+50 mV,300 ms的测试刺激,以单项指数式I=A×exp(-t/τ)求解出Ito关闭态失活时间常数。

Ito失活后恢复曲线:钳制电位设置在-40 mV,给予+50 mV,300 ms去极化刺激,再恢复到-80 mV,在40、80、160、320、640、1 280、2 560和5 120 ms的时间间隔后,再施加第2次测试刺激,参数为+50 mV,300 ms,将第2次所引出的电流与预刺激电流相比较,利用单项指数式算出恢复时间常数。

IKUr:钳制电位设置在-80 mV,给予500 ms,-40～+50 mV去极化刺激,将IK,peak诱发出来,利用电流减除法来将此电流减除Ito,最后得到IKUr电流。

1.6统计学方法 采用SPSS19.0软件进行单因素方差分析、SNK-q检验。

2 结 果

2.1大蒜素对小鼠心房肌细胞IK,peak的作用 在+50 mV时,大蒜素组电流峰值密度〔(36.3±3.4)pA/pF〕显著低于对照组〔(57.2±4.5)pA/pF;n=10,t=4.972,P<0.001〕,见图1。

图1 大蒜素对小鼠心房肌细胞IK,peak的影响

2.2大蒜素对小鼠心房肌细胞Ito电流密度的影响 大蒜素组与对照组相比较,Ito的电流密度明显降低〔(14.1±2.2) vs (25.0±1.6)pA/pF,n=10,t=5.327,P<0.001〕,且抑制效应随着药物剂量的增加更加明显。进一步,在不同浓度(1.0、3.0、10.0、30.0、100.0 μmol/L)的大蒜素阻滞作用下,Ito呈现浓度依赖性,其中半数抑制量(IC50)为(21.0±3.8)μmol/L,希尔系数为0.98,见图2。

A.大蒜素对电流影响的原始记录图; B.大蒜素对电流阻滞的浓度依赖性特征;C.大蒜素对电流阻滞的电压依赖性特征图2 大蒜素对小鼠心房肌细胞Ito的作用

2.3大蒜素对小鼠心房肌细胞Ito作用的电压依赖性 小鼠心房肌细胞Ito电流大约在-10 mV刺激时被激活,随着刺激脉冲呈现出向去极化方向移动趋势,外向整流特征较为明显,见图2。大蒜素组电流密度在各个电压下均显著降低,尤其在+20 mV以上,电流密度的降低随着刺激电压的增加更加显著,由此表明,大蒜素对Ito的阻滞效应呈现出电压依赖性的特征。

2.4大蒜素对小鼠心房肌细胞Ito稳态激活和稳态失活的作用 大蒜素组心房肌细胞Ito的稳态激活曲线向右移动,半激活电压(V1/2act)和激活曲线斜率(kact)稍有变化。大蒜素对通道的稳态激活过程有轻微的减慢作用可能对抑制通道电流的效应有影响。大蒜素组Ito稳态失活曲线向左移动,其半失活电压(V1/2,inact)与对照组〔(-42.5±3.1)mV〕比较移到(-63.7±2.6)mV,差异有统计学意义(n=10,t=6.898,P<0.001),对照组失活曲线斜率(kinact)为(17.5±1.1)mV,大蒜素组为(15.6±1.7)mV,没有显著性差异(t=1.259,P>0.05),见图3。

A.大蒜素对电流稳态失活过程作用的原始记录图;B.大蒜素对电流稳态失活曲线的影响图3 大蒜素对Ito稳态失活曲线的作用

2.5大蒜素对小鼠心房肌细胞Ito关闭态失活的作用 与对照组〔(57.62±5.22)ms〕比较,大蒜素组关闭态失活时间常数缩短,但差异无统计学意义〔(52.36±4.54)ms,t=1.020,P>0.05〕,大蒜素对Ito通道的关闭态失活时间参数影响不大。显示了大蒜素对通道电流的抑制作用主要与稳态失活过程有关,而与通道的关闭态失活过程关系不大,见图4。

图4 大蒜素对Ito电流关闭态失活的影响

2.6大蒜素对小鼠心房肌细胞Ito失活后恢复曲线的影响 从图5可看出,大蒜素组心房肌细胞Ito的失活后恢复过程显著减慢,恢复时间常数(τ)明显延长,与对照组〔(304.8±15.7)ms〕比较延长至〔(573.3±18.2) ms,n=10;t=14.987,P<0.001〕,恢复曲线向右移动明显,显示Ito通道的失活后恢复过程减慢。

A.大蒜素对电流失活后恢复作用的原始记录图;B.大蒜素对电流失活后恢复时间常数作用的电压依赖性图5 大蒜素对Ito失活后恢复曲线的作用

2.7大蒜素对小鼠心房肌细胞IKUr的作用 在+50 mV,与对照组比较,大蒜素组峰值密度从(25.8±3.5)pA/pF显著降低为(18.1±1.9)pA/pF(n=10,t=2.595,P<0.05),见图6。

图6 大蒜素对小鼠心房肌细胞IKUr电流的影响

3 讨 论

房颤的发生与发展原因众多、机制复杂,仅从单个离子流的作用将很难完整地解释其发生发展的机制,治疗也很难达到理想的效果。因此,寻找同时作用于多种电流的药物将是今后一个新的研究方向〔7〕。研究发现别隐品碱可降低小鼠心房肌细胞T-型钙电流密度,推测该药物在房颤的发生和治疗等方面有作用〔8〕。研究显示,大蒜素可以通过多种信号转导通路发挥其对心血管疾病的治疗作用〔9～11〕,也有研究其发挥治疗作用的分子机制〔12〕,可见大蒜素有很好的研究开发前景。

研究发现,大蒜素可有效阻滞IK,peak电流可能是通过抑制小鼠心房肌细胞上IKUr和Ito电流密度,这种多电流同时阻滞的效应将对延长2相和3相动作电位复极有更好的作用,此效应对于诱发房颤的早后除极和微折返可能有较好的抑制作用,进而对减缓房颤的发生可能有一定的影响。本研究发现,大蒜素降低Ito电流密度的作用呈现出电压依赖性特征,即药物作用随着去极化电压的升高而增强。大蒜素的抑制效应还表现出浓度依赖性,其中半数抑制量(IC50)为(21.0±3.8)μmol/L,此浓度仅为药物直接作用于细胞的剂量,若在动物整体水平,还需进一步研究验证,然而,此剂量可作为重要参考。

本研究结果表明,在相同的去极化电压之下,通道的稳态失活更多。大蒜素可以延缓Ito通道失活状态下的恢复过程,通道失活后再次开放所需的时间延长。由此推断,大蒜素通过影响Ito通道的稳态失活及失活后恢复动力学的过程来降低Ito电流密度。大蒜素可能主要作用于开放态通道,即大蒜素可能在通道开放时与通道分子结合,改变了通道的空间构象,进而降低对K+的透过〔13〕。但药物究竟与通道大分子的结合域定位还需进一步机制还有待探讨。

本研究未能检测小鼠心房肌细胞钾离子通道分子的表达情况,无法判断大蒜素是否对离子通道的基因和蛋白的合成、多种β亚基调控及细胞膜分布有影响〔14,15〕。故本实验仅从细胞电生理水平展示药物的效果及从通道门控动力学角度揭示药物作用的机制,难以从分子层面揭示药物的作用基础。另外,实验若能直接观察药物对动物房颤模型的作用,记录大蒜素对房颤发生率的效应,将更有说服力。

本实验结果揭示,大蒜素对小鼠心房肌细胞多种钾电流有阻滞效应,推测该药物对减少房颤发生和维持等方面有着治疗作用,希望通过进一步的实验研究使其成为治疗房颤的新药物。