谢树章 杨小艳 吴 红 韩 垚

（重庆市农业科学院生物技术研究所，逆境农业研究重庆市市级重点实验室，重庆 401329）

玉簪属（HostaTratt.）是百合科多年生宿根草本植物，因花型形似古人头饰玉簪而得名，耐阴耐寒[1]，品种繁多，株型大小各异，叶片的形状、大小、颜色、纹理和质地等各不相同[2-3]，被广泛应用于园林地被、花境和盆栽观赏，是重要的观花观叶的阴生植物[4-5]。近年来随着玉簪属植物园林绿化应用的增多，玉簪特别是新培育或新引进的玉簪新品种由于母株资源较少，且传统方法繁殖速度慢，难以满足市场需求[6-7]。通过离体组织培养的方式繁育玉簪种苗，可快速繁殖大量优质种苗，保持玉簪亲本的优良性状[8]，育苗周期短，出苗一致性高[9-10]，同时可减少土地占用及人力物力消耗、避免病虫危害[11-12]，具有很好的经济效益和应用前景。目前已有研究人员对‘金鹰’玉簪[13]、‘大父’玉簪[7]、‘蓝天使’玉簪[14]、‘翠鸟’玉簪[15]等开展离体组织培养技术研究，结果表明不同玉簪品种适宜的不定芽诱导、增殖和生根的培养基植物生长调节剂配比组合有较大差异，玉簪组培快繁可能受基因型的影响较大。‘金标’玉簪，属中型玉簪，叶片心形至卵形，叶质较厚，叶心黄色，边缘绿色，花紫色，花期7—9 月，耐寒、耐阴，地下茎粗壮，分蘖能力强，长势繁茂，是少有的黄心绿边花叶优良玉簪品种，其组织培养技术研究尚未见报道。本研究以幼嫩腋芽为外植体，建立‘金标’玉簪组培快繁体系，为‘金标’玉簪种苗快速繁殖规模化生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

供试玉簪品种‘金标’玉簪取材自重庆寰宇金禾园艺有限公司花卉基地。

1.2 方法

1.2.1 外植体的消毒处理 选取长势健壮、叶片色泽亮的优良植株，以其幼嫩腋芽作为试验材料，先用洗衣粉泡洗，在流水下冲洗1～2 h。然后置于70%乙醇溶液中浸泡处理30 s，倒掉70%乙醇溶液后，用灭菌水冲洗2次。再用0.1% HgCl2溶液加2滴Tween-20 分别消毒5、10、15、20 min，并不断摇动。将HgCl2溶液倒出，用灭菌水冲洗5～6次，用无菌滤纸吸干水分后将腋芽外包叶片剥掉，切取带生长点分生组织接种到诱导培养基MS+（3 mg/L 6-BA）+(0.10 mg/L NAA)+30 g/L 蔗糖+7 g/L 琼脂中，每个处理接种20瓶，每瓶接种2个外植体材料，及时观察外植体污染情况并记录，60 d后统计外植体污染率、存活率和死亡率及不定芽生长情况。

污染率（%）＝（污染的外植体数/接种外植体数）×100；

死亡率（%）＝（未污染但腋芽褐化死亡的外植体数/接种外植体数）×100；

存活率（%）＝（未污染且腋芽正常的外植体数/接种外植体数）×100。

1.2.2 诱导培养 以MS 培养基为基本培养基，设置不同浓度6-BA 和NAA 组合诱导培养基，命名为Y1、Y2、Y3、Y4。将消毒处理好的腋芽外包叶片剥掉，切取带生长点芽组织，接种到Y1～Y4培养基中，温度25 ℃，光照强度2 500～3 000 lx，光暗交替12 h，每个处理接种20 瓶，每瓶接种2 个腋芽，观察外植体生长发育状态，60 d 后统计丛生芽诱导情况。

1.2.3 继代增殖培养 设置不同浓度6-BA 和NAA组合的继代增殖培养基，命名为A1～A9培养基。切下增殖的丛生芽，接种到以下培养基MS+（2、3、4 mg/L 6-BA）+（0.05、0.10、0.20 mg/L NAA）+30 g/L蔗糖+7 g/L琼脂中。每个处理接种4瓶，每1瓶接种5 个芽块，3 次重复。光照强度为2 500～3 000 lx，光暗交替12 h，温度25 ℃，40 d 后统计增殖情况。计算公式：增殖系数=新芽数/接种数。

1.2.4 生根培养 挑取健壮继代芽苗接至生根培养基G1～G7中壮苗生根，每个处理接种1盒，每盒接种50株苗，3次重复。光照强度为2 500～3 000 lx，光暗交替12 h，温度25 ℃。每天观察并记录组培苗生根时间（试验处理内部超过50%组培苗生根的时间），30 d后统计生根情况，确定最佳生根培养基。生根率（%）=（生根苗数/接种数）×100；平均根数（%）=（总根数/生根苗数）×100。

2 结果与分析

2.1 外植体的消毒处理与诱导培养

0.1 % HgCl2溶液不同的处理时间对玉簪腋芽的消毒效果不同（表1）。

由表1 可见，玉簪腋芽在0.1% HgCl2溶液处理5 min 的消毒效果最差，污染率达到77.5%。随着处理时间的增加，污染率显著降低，在20 min时外植体污染率降至12.5%；外植体死亡率随着0.1% HgCl2溶液消毒时间的增长而上升，说明0.1% HgCl2溶液处理时间过长会对外植体造成毒害作用，故外植体玉簪腋芽用0.1% HgCl2溶液消毒处理时间选为15 min 较佳，污染率可控制在15.0%，存活率达到75.0%，同时腋芽正常萌发，基部微膨大，不定芽逐渐出现。

2.2 诱导培养

玉簪腋芽接种到诱导培养基上，随着时间推移，腋芽基部逐渐膨大，然后出现不定芽，各个处理诱导玉簪腋芽产生不定芽的效果不同（表2）。

表2 不同诱导培养基不定芽生长情况统计

由表2 可见，外植体在Y1～Y4培养基的上的不定芽诱导率在85.0%～90.0%，在Y2培养基上最高，诱导率达到90%；从不定芽的生长情况对比，不定芽的质量和生长速度差异明显，在Y1和Y2培养基上不定芽生长正常，健壮，且在6-BA 为5 mg/L的Y2培养基上不定芽生长出芽时间短，速度快。当NAA 浓度为1.00 mg/L 时，不定芽生长受到影响，偏小，且生长缓慢，生长势较弱，部分出现轻微玻璃化。因此，选择MS+（5 mg/L 6-BA）+（0.50 mg/L NAA）培养基作为不定芽诱导培养基较为合适。

2.3 继代增殖培养

由表3 可以看出，植物生长调节剂6-BA 和NAA 的不同配比对玉簪丛生芽增殖影响很大。在6-BA 在5 mg/L 时新生芽都较小较弱，在4 mg/L 时增殖系数较高，同时芽苗也较正常。另一方面，NAA 在浓度在0.25 和0.50 mg/L 时，芽苗生长正常，比较健壮，同时繁殖系数也较高。随着NAA 浓度的继续增加，芽变弱，矮化，基部出现愈伤，甚至玻璃化，叶片黄化。综合考虑，培养基A6上的芽苗健壮（图1），丛生芽增殖数较多，增殖系数达到4.12，是比较理想的继代增殖培养基。

表3 不同继代增殖培养基丛生芽生长情况统计

2.4 生根培养

本研究把NAA 和IBA 单独使用用于诱导组培苗生根，从表4可看出，不添加植物生长调节剂的G1培养基上，组培苗生根时间较长，且生根率较低。而添加植物生长调节剂的处理G2～G7能提高生根率，加快生根速度，与对照相比达到显著水平。在G4和G7培养基中，部分组培苗基部出现了轻微玻璃化，影响了新根的质量，后续移栽时也会造成移栽成活率下降。而在G3培养基中（图1），出根时间短，组培苗生根率达到96.67%，平均根数达到5.76，故确定G3培养基作为玉簪组培苗生根壮苗培养基使用。

表4 植物生长调节剂对玉簪组培苗生根的影响

3 结论

玉簪组织培养的外植体一般选用腋芽和花器官作为外植体材料，冯慧等[16]采用花葶作为外植体材料，污染率较低，再生出不定芽，建立了玉簪花器官植株再生体系，但由于花器官受生长季节影响，取材时间受限，而腋芽丛生法以其操作简便，繁殖速度快，可保持遗传稳定性的优势广泛用于园艺、农林果树等林木植物的组培繁殖[17-18]。在本研究中，通过幼嫩腋芽作为外植体材料，可在春季开展试验，通过筛选确定0.1% HgCl2溶液最佳消毒时间为15 min，控制外植体污染率在15%以内。

植物激素的配比对芽的诱导启动和增殖均有显著影响，其中6-BA 为细胞分裂素，具有促进细胞分裂和扩大、诱导芽的分化作用，NAA 为生长素，具有促进植物伸长生长的作用[19-20]。本研究利用6-BA和NAA 的组合诱导‘金标’玉簪外植体直接分化出不定芽，不经过愈伤组织诱导阶段，遗传性状稳定，继而4 mg/L 6-BA 和0.50 mg/L NAA 配合使用，有效促进了丛生芽增殖，芽健壮且长势快。一般来讲，无机盐浓度低，有利于根的生长[21]，本研究采用1/2 MS培养基作为基础培养基，添加IBA或NAA均能有效诱导玉簪生根，这与郝砚英、陈必胜等［22-23］研究结果一致。

综上所述，本研究筛选了适合‘金标’玉簪腋芽的消毒处理方法：最佳不定芽诱导培养基为MS+（5 mg/L 6-BA）+（0.50 mg/L NAA），最佳的丛生芽继代增殖培养基MS+（4 mg/L 6-BA）+（0.50 mg/L NAA），最佳的生根培养基1/2 MS+（0.50 mg/L IBA）。通过应用上述技术体系本实验室已生产‘金标’玉簪组培苗近3 万株，采用草炭∶珍珠岩（3∶1）作为基质移栽至128 孔育苗盘中，根据环境条件进行适时喷淋和遮阴，最终移栽成活率达到94.5%，初步建立了‘金标’玉簪组培快繁体系，可为‘金标’玉簪进行种苗繁殖规模化生产提供参考。