吕欢欢 郝浩浩 李 翔 周俊学 吴俊林 孙会忠

（1河南科技大学农学院，河南洛阳 471003；2河南烟草公司驻马店市公司，河南驻马店 463000；3河南省烟草公司洛阳市公司，河南洛阳 471003）

获得优质的促生菌是提高烟草品质的切入点之一，目前已报道的植物生长促进菌（plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）主要包括假单胞菌属（Pseudomonas）、芽孢杆菌属（Bacillus）、肠杆菌属（Enterobacter）和伯克霍尔德氏菌属（Burkholderia）等[1-3]，在烟草促生方面发挥了重要作用。但单一促生菌作用机制单一[4]，受环境影响大[5]。因此，寻找多功能促生菌具有重要的理论和现实意义。皮特不动杆菌（Acinetobater pittii）为莫拉菌科（Bacillaceae）不动杆菌属，是一类广泛存在于水体和土壤的重要根际有益菌。皮特不动杆菌不仅能够抑制烟草黑胫病[6]，还能高效解磷解钾[7]，促进植物的生长，具有巨大的生物应用价值。

烟草（Nicotiana tabacum）属茄科一年生或有限多年生草本植物[8]，是一种重要的经济作物。随着种植面积的扩大和难以避免的多年连作，烟叶生产受烟草病害影响严重，造成的年平均产量损失达10%左右[9]。使用化学药剂防治是我国农业生产中快速防治病害的有效手段，但长期使用化学药剂易导致烟草农药残留、病害产生抗药性等问题，对烟草质量产生了不良影响[10-12]。微生物防治具有安全绿色、环境友好等优势，受到国内外各方广泛关注[13]。烟草病害防治菌剂的开发研究资源丰富，但目前有关广谱抑制真菌的不动杆菌的报道不多，且不动杆菌对烟草促生作用的研究较少。

为丰富促生烟草生长菌种资源，本研究从烟草根际土壤中分离可培养内生细菌，筛选出对烟草生长具有促生作用的菌株，同时评估目的菌株的生物活性，明确目的菌株的分类信息，并通过盆栽试验验证目的菌株的促生效果，为烟草促生菌剂的开发提供菌种资源。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 土样和烟草品种 土壤样品采自河南省驻马店市确山县植烟区团棵期至成熟期健康烟株根际土壤，共10份。供试烟草品种为云烟87。

1.1.2 供试培养基和试剂 采用肉汤培养基（LB）和营养琼脂培养基（NA）进行细菌的分离与纯化[14]；采用马铃薯培养基（PDA）进行病原真菌的培养及平板对峙试验[15]；采用营养肉汤培养基（NB）进行细菌悬液的制备及菌种的活化[16]；采用蒙金娜有机磷培养基和无机磷培养基（PKO）进行菌株的溶磷活性鉴别；采用钾长石培养基进行菌株的解钾活性鉴别[17]；采用羧甲基纤维素钠培养基（CMC-Na）进行菌株的纤维素分解活性鉴别[18]；采用TaKaRa MiniBEST细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株DNA。

1.1.3 供试病原真菌 指示病原真菌包括小麦根腐病菌（Fusarium culmorum）、番茄枯萎病菌（F.oxysporum）、牡丹黑斑病菌（Alternaria suffruticosae）、小麦灰霉病菌（F.graminearum）、牡丹灰霉病菌（Botrytis paeoniae）、牡丹黄斑病菌（Phyllosticta commonsii），均保存于河南科技大学农学院微生物实验室。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株的分离纯化 采用温度筛选法和平板稀释涂布法[19]从采集的土壤样品中分离纯化内生细菌，将培养得到的表面褶皱程度不同、边缘不同、大小不同、颜色不同的可培养植物内生细菌依次编号，纯化后放在终浓度15%甘油中于-20 ℃冰箱保存备用。

1.2.2 菌株抑菌谱的测定 采用平板对峙法，以6 种病原真菌为指示菌株，无菌条件下将待测菌株点接于病原菌相等距离十字交叉线的四端，28 ℃恒温培养3 d，3 次重复，以仅接病原真菌作为空白对照。当空白对照的病原菌长满平板时，观察并测量接种拮抗菌的培养皿中菌落直径[20]，计算相对抑制率，计算方法如下：相对抑制率（%）=（对照菌落直径-处理菌落直径）/（对照菌落直径-5）×100。

1.2.3 菌株促生活性测定 （1）溶磷、解钾菌活性筛选：将菌株分别接种到有机磷培养基、PKO和钾长石培养基上，28 ℃恒温培养3 d，测量透明圈直径D、菌落直径d，根据D/d大小初步筛选溶磷、解钾菌[21-22]。

（2）产纤维素酶活性筛选：将菌株点接于CMCNa 培养基，28 ℃恒温培养3 d 后，0.1%刚果红浸润20 min，1 mol/L NaCl 冲洗，测定菌落直径d和透明圈直径D，并计算比值（D/d）[23]。

（3）IAA能力测定：于1 000 r/min下离心菌株菌悬液10 min，取上清液，上清液与比色液按照1∶1加入白色陶瓷板上，室温避光放置30 min 后观察混合液显色变化，以40 µg/mL IAA 标准溶液为阳性对照，不接菌的LB 液体培养基为阴性对照，混合液为粉色或红色表明具有产IAA 活性，混合液为透明无色则表明不具有产IAA活性[24]。

1.2.4 多相鉴定 （1）形态和生理生化鉴定：形态学观察参照《不动杆菌属》，观察菌株的颜色、形体大小、表面黏稠度等特征并记录，同时取少量菌体进行革兰氏染色，电子显微镜下镜检并拍照。根据《伯杰氏细菌鉴定手册》与《常见细菌系统鉴定手册》中介绍的不动杆菌属生理生化试验进行，以此对筛选出来的拮抗菌株进行初步鉴定[25]。

（2）分子生物学鉴定：使用TaKaRa MiniBEST DNA 提取试剂盒提取菌株的基因组，细菌通用引物27F（5′-AGTT-TGATCMTGTCCAG-3′）和1492R（5′-GGTT-ACCTTTACGCTT-3′）进行扩增。1.5%琼脂糖凝胶电泳后纯化PCR产物，并送公司测序[26]。采用MEGA 7.0软件构建系统发育树，确定菌株的分类地位。

1.2.5 菌株对烟草的促生作用 采用盆栽试验，设3 个处理，分别为：CK，空白对照处理；处理T1，每株均用等量的1×108CFU/mL 微生物菌株发酵液灌根；处理T2，枯草芽孢杆菌菌剂灌根。各处理除微生物菌剂不同以外，其余的栽培管理措施均相同。每个处理3次重复。在烟草生长前后每7 d处理1次，共处理3 次，最后一次处理42 d 后开始调查植株的株高、茎围、节距、最大叶面积等生物量指标，并观测植株的光合速率等指标，统计和评估不同处理对烟草植株生长的影响[27]。

1.3 数据处理

对试验数据进行统计分析，采用SPSS 27.0进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 菌株分离筛选结果

从10 份烟草根际土样中共分离到35 株菌株，以6 株病原菌为指示菌进行筛选，得到菌株YC-25。试验结果表明，菌株YC-25 对番茄枯萎病菌抑制效果最好（图1L），对小麦灰霉病菌和牡丹黄斑病菌抑制效果稍弱（图1B、H），对小麦根腐病菌、牡丹灰霉病菌和黑斑病菌抑制效果最弱（图1D、F、J），平均抑菌率达到48%（图2）。光学显微镜观察发现，正常未受抑制菌丝密集交织，分枝丰富，菌丝完整、表面平滑（图1M）；受抑制菌丝通常表现出局部膨大、集结，幼嫩菌丝数量减少，分枝稀疏或密集（图1N、O、P）。

图1 菌株YC-25对6种病菌的拮抗作用

2.2 菌株YC-25的促生功能活性

（1）溶磷、解钾活性：菌株在无机磷培养基和钾长石培养基上均出现明显透明圈（图3A、B），菌株YC-25的溶磷可溶性指数为1.33，解钾指数为1.31。

图3 菌株YC-25的促生功能活性鉴别

（2）分解纤维素活性：菌株YC-25可在CMC-Na培养基上产生透明圈（图3C），D/d=1.9。

（3）产吲哚乙酸（IAA）特性：定性与定量结果分析，菌株YC-25具有分泌IAA的能力，显色反应为粉红色，分泌量为39.05 µg/mL（图4C）。

图4 菌株的IAA显色反应

2.3 菌株YC-25形态特征

2.3.1 菌株的形态和生理生化特征 菌株YC-25在LB培养基培养2 d后观察，单菌落呈淡黄色，不透明，表面光滑湿润，中间略微凸起菌落较为黏稠，边缘不规则（图5A）。革兰氏试剂染色后鉴定为革兰氏阴性菌株（图5B），菌体呈短杆状，直径为0.3～0.5 µm，长1.3～2.2 µm，无芽孢，无荚膜，无鞭毛（图5C）。

图5 菌株YC-25的形态特征

生理生化结果显示，不可水解蛋白酶和果胶酶，能水解尿素，氧化酶反应、硝酸盐还原试验、V-P 试验、明胶液化试验、接触酶试验为阴性。糖醇类发酵试验结果显示，蔗糖、阿拉伯糖、葡萄糖、木糖和乳糖为阴性。依据试验结果，菌株YC-25 符合不动杆菌属种群特征描述。

2.3.2 菌株YC-25的16S rRNA序列分析特征 测序结果显示菌株YC-25的基因序列长度为1 030 bp，提交至GenBank 数据库（登录号为OR125558）。通过比对发现，菌株YC-25 与Acinetobacter pittiiLMG1035（NR 117930.1）聚在同一分支，相似度达到99%。综合菌株YC-25 的形态、生理生化及基因序列分析，鉴定为不动杆菌（Acinetobater pittii），暂命名为Acinetobater pittiiYC-25（图6）。

图6 YC-25的16S rRNA系统发育树

2.4 菌株YC-25对烟草的促生效果验证

盆栽试验验证菌株发酵液（1×108CFU/mL）对烟草的促生效果显示，处理42 d 后，处理T1的净光合速率、气孔导度和蒸腾速率略高于处理T2，显著高于CK，胞间CO2浓度低于CK 和处理T2（表1），说明菌株处理后的烟株生理活性较强。处理T1烟株各项农艺性状均高于CK 和处理T2，与CK 相比，处理T1烟草株高增加了26.29%，茎围增加了27.54%，最大叶面积增加了17.26%（表2）。图7 显示，处理T1烟草叶片宽厚、浓绿，新生根系更加发达，说明菌株YC-25对烟草生长产生了较好的促进作用。

表1 不同处理的生理参数

表2 不同处理农艺性状的比较

图7 不同处理烟株生长状况

3 结论与讨论

周亚男等[28]研究表明，从烟草根际土壤分离出来的假单胞菌（P.koreensisHCH2-3）、浅黄绿假单胞菌（P.luridaFGD5-2）和贝莱斯芽孢杆菌（B.velezensisEM-1）对烟苗呈现不同程度的促生作用。本研究从烟草根际土壤中筛选出的一株高效促生菌株，对6 种病原真菌平均抑菌率为48%，经多相鉴定属于皮特不动杆菌，丰富了烟草促生菌种资源库。大多数研究表明，皮特不动杆菌主要功能为降解纤维素[29-30]和高效分解有机磷及无机磷[31]。烟草促生过程中，关于皮特不动杆菌促进烟草生长的相关产品较少，本试验筛选获得的促生菌不动杆菌YC-25，为烟草促生及生物菌剂开发提供了重要的资源。菌株在防治枯萎病菌的同时，对黄斑病菌、黑斑病菌等其他植物病菌也具有生物防治作用，抑菌谱较广。菌株YC-25分泌IAA的同时，兼具解磷、解钾活性和产纤维素酶能力，对烟草发育产生促进作用。因此，菌株YC-25 作为促生菌开发潜力巨大，在后期的研究中，可对菌株的发酵特性和次生产物进行开发。不动杆菌在防控植物病害、促进植物生长等方面发挥着重要作用，但其在植物体内的代谢过程、调控机制和对植物的作用效果等还需要更多的研究，以明确不动杆菌在农业生产中的应用效果，并为其发展和推广提供理论基础。当下，不动杆菌在农业生产中的应用研究相对较少，但随着其生物防治效果和环境安全性越来越受到人们关注，不动杆菌将会有更广阔的发展前景。