何曦,陈方圆,孙文静,郑明鹏,宋琳娜,朱袁正鸿,樊西曼,张军翔,3*

1(宁夏大学 农学院,宁夏 银川,750021)2(宁夏大学 食品与葡萄酒学院,宁夏 银川,750021)3(葡萄与葡萄酒教育部工程研究中心,宁夏 银川,750021)

加强型葡萄酒(fortified wines)又称利口葡萄酒,指加入葡萄酒精或白兰地终止部分发酵或未发酵的葡萄酒,使部分葡萄糖和果糖保留在酒中,经过陈化最终得到自然甜型的加强型葡萄酒[1]。在一些欧洲国家中,利用这种独特工艺生产的加强型葡萄酒已至少有300年的历史[2]。雪莉、波特和马德拉酒是3种典型的加强型葡萄酒,这类酒的特点是酒精和总糖含量较高,酒精含量通常在15%～22%(体积分数),含糖量通常在60 g/L以上[3]。高酒精度抑制微生物生长,提高了酒的稳定性;高糖分会引起美拉德反应并产生大量的挥发性成分,其中葫芦巴内酯、糖醛和5-甲基糠醛等是高糖高酒精作用下典型的香气物质[4-6]。不同加强型葡萄酒因不同的工艺特别是陈化过程不同,会存在香气感官特性的差异。

雪莉酒(Sherry)是产自西班牙南部的赫雷斯(Jerez)地区,由当地白葡萄品种“帕罗米诺(Palomino)”酿造而成。通常雪莉酒在橡木桶的陈酿中,表面会形成一层叫做“酒花”的酵母膜,这种生物膜是由一种弗洛尔酵母菌(Flor yeasts)生成[7],这种酵母在生物老化过程中发生自溶现象,自溶过程会溶解出许多化合物,如氨基酸、肽、核苷酸、酯、醇、醛、酸和内酯等化合物,其中葫芦巴内酯、异丁醇、2-苯基乙醇和异戊醇等挥发物都会对雪莉酒独特风味的形成产生影响[8-11]。波特酒(Port)产于葡萄牙波尔图市的杜罗地区,通常波特酒的典型风味是来自橡木桶中长时间的陈酿,口感呈现坚果、辛辣和橡木的味道[12]。ROGERSON等[13]的研究发现波特酒在陈化过程中己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、肉桂酸乙酯等挥发性成分在酒中大幅增加,提高了酒中的果味和辛辣等复杂的香气。马德拉酒(Madeira wine)产于葡萄牙的马德拉群岛,通常要将酒加热至50 ℃陈化3个月[14],在此过程中马德拉酒产生葫芦巴内酯、5-甲基糠醛和糠醛等典型风味物质,赋予马德拉酒烘烤、焦糖和坚果味[15]。而非加强型葡萄酒的酿造工艺通常需要将糖发酵至4 g/L以下,酒精度为12%～15%(体积分数),由于含糖低和酒精度低,葡萄酒呈现出果香、花香和青椒味[16]。不同类型的加强型葡萄酒都具有独特的香气特征,但高酒精度和高糖的条件下陈酿必然会有共有的香气特征和挥发性成分,目前此方面的研究鲜有报道。

本研究选取典型加强型葡萄酒作为研究对象,以贺兰山东麓产区的红、白葡萄酒为对照,探究典型加强型葡萄酒的香气感官特征及挥发性成分的差异,为后续加强型葡萄酒的生产和质量评价提供基础数据支撑和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酒样:收集相似年份的西班牙雪莉酒、葡萄牙波特酒和马德拉酒各3款,贺兰山东麓产区干红葡萄酒和白葡萄酒各3款,其中雪莉酒和白葡萄酒由白色葡萄品种酿造,马德拉酒、波特酒和干红葡萄酒由红色葡萄品种酿造,具体信息见表1。

表1 酒样信息Table 1 Information on wine samples

试剂:没食子酸(分析纯),烟台市双双化工有限公司;NaOH、NaCl、酚酞、无水葡萄糖、次甲基蓝(均为分析纯),天津市科密欧化学试剂有限公司;福林酚,上海瑞永生物科技有限公司;HCl,国药集团化学试剂有限公司;无水乙醇、酒石酸钾钠(均为分析纯),天津市永大化学试剂有限公司;Na2CO3、CuSO4、邻苯二甲酸(均为分析纯),天津市大茂化学试剂有限公司;4-甲基-2-戊醇(≥98.0%, GC),日本TCI公司;C8～C20正构烷烃(≥99.7%, GC),美国Sigma-Aldrich公司。

1.2 仪器与设备

7890B-7000D型气相色谱-质谱联用仪、DB-WAX色谱柱(60 m×250 μm, 0.25 μm),美国Agilent公司;PAL3自动进样器,瑞士CTC公司;TU-1901型分光光度计,北京普析通用仪器有限公司;雷磁PHS-3C pH计,上海仪电科学仪器股份有限公司;ME104E电子天平,瑞士METTLE公司。

1.3 实验方法

1.3.1 理化指标测定

可滴定酸、总糖、二氧化硫的测定方法参照 GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》;酒精度的测定方法参数GB 5009.225—2016《酒中乙醇浓度的测度》;pH值使用pH计测定;总酚的测定参照福林-肖卡法[17]的方法测定;单宁的测定参照李蕊蕊[18]的方法测定;色度、色调的测定参照郑秋玲等[19]的方法。

1.3.2 挥发性成分测定

参考张众等[20]的方法利用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术对典型加强型葡萄酒(雪莉酒、波特酒和马德拉酒各3款)和非加强型葡萄酒(干红葡萄酒和白葡萄酒各3款)进行挥发性成分检测。

样品前处理:在20 mL的顶空瓶中依次放入1.5 g NaCl、 5 mL酒样、10 μg/L的4-甲基-2-戊醇(内标,1.008 3 g/L)和磁力转子,再将顶空瓶置于磁力搅拌机中,并放入纤维萃取头,在50 ℃水温和转速250 r/min下萃取30 min。

质谱条件:离子源温度230 ℃;传输线温度230 ℃;电子能量70 eV;质量扫描范围m/z29～300。

色谱条件:载气高纯氦气(纯度≥99.999%),流速1 mL/min,不分流进样;DB-WAX色谱柱(60 m×250 μm, 0.25 μm);进样口温度230 ℃;升温程序:起始柱温度50 ℃,恒温1 min,以3 ℃/min升至220 ℃。

1.3.3 定性与定量分析

将挥发性成分的香气质谱图,通过NIST 17谱库进行检索,确定挥发性成分,并使用保留指数法(retention index,RI)计算各挥发性成分的保留指数从而进行定性分析。采用外标法进行定量,定量分析使用62种不同挥发性成分制成的混合物,进行校准曲线定量,所有的标准分析各做2次;对于典型加强型葡萄酒和非加强型葡萄酒中没有参考的挥发性成分根据相近结构的化合物标准进行定量[21];共有12种挥发性成分(2-糠酸乙酯、戊二酸二乙酯、葫芦巴内酯、肉豆蔻酸乙酯、肉桂酸乙酯、正癸醇、苯甲醇、叶醇、橙花叔醇、2-羟基-3-甲基丁酸、5-甲基糠醛和2,4-二叔丁基苯酚)使用相近标准浓度进行定量,并用于数据分析。

1.3.4 香气特征感官分析

由20名具有2年以上品酒经验的专业人员(年龄20～45岁、男女比例11：9)组成感官品鉴小组。参考杨洋等[22]的定量描述法,每位感官品鉴员尽可能多地描述外观、香气、口感等感官描述词,最终通过感官品鉴小组共同讨论形成典型加强型葡萄酒和非加强型葡萄酒的感官描述词及定义。按照GB/T 29604—2013的方法确定合适的感官描述词。

将选出的酒样感官描述词呈给感官品鉴员,典型加强型葡萄酒与非加强型葡萄酒以盲品的方式进行,在标准品酒室(ISO 8589—1998)使用标准品酒杯(ISO 3591—1997)进行评鉴。品鉴表制定参照葡萄酒风味化学中的评分规则对典型加强型葡萄酒和非加强型葡萄酒的香气特征进行打分[23],香气特征及评分依据见表2。

表2 香气特征及评分依据Table 2 Rules for aroma characteristic scoring

1.3.5 气味活度值的计算

采用气味活度值(odour activity value,OAV)法,参考文献[24]的算法,OAV按照公式(1)进行计算:

(1)

式中:浓度为定量后的挥发性成分浓度。

1.3.6 数据统计分析

采用Microsoft Office 2021软件进行数据统计;OAV>1的挥发性成分进行主成分分析(principal component analysis,PCA),感官轮廓图以及挥发性成分的聚类热图,用Origin 2021软件作图。

2 结果与分析

2.1 基本理化指标分析

典型加强型葡萄酒与非加强型葡萄酒的理化指标如表3所示,典型加强型葡萄酒的酒精度和总糖都高于非加强型葡萄酒;典型加强型葡萄酒总酸的范围为2.97～4.89 g/L普遍低于葡萄酒,这与其他甜型葡萄酒高酸平衡高糖的情况不同[25];SW色度的范围为1.41～2.78,色调的范围为2.93～3.90,而WW色度和色调的范围为0.24～0.35和0.85～0.92,说明SW的颜色较深,黄色色调较深;RW、PW和MW的色度范围依次为10.81～12.64、9.23～11.23和1.11～5.90,色调依次为0.91～0.97、0.93～1.00和2.67～3.91,表明RW的颜色较深,红色色调较重;典型加强型葡萄酒色度大小不一,但色调偏高,也说明加强型葡萄酒的颜色主要和褐变反应有关[26]。加强型葡萄酒中,酚类物质的氧化会导致酒体抗氧化能力的降低,但会产生新的多酚类化合物,对加强型葡萄酒的颜色和味道产生影响[27-28]。典型加强型葡萄酒总酚的范围为209.57～1 794.80 mg/L,均低于RW,其中MW的总酚含量在典型加强型葡萄酒中含量较高;典型加强型葡萄酒的单宁范围为193.80～429.67 mg/L,其中RW的单宁含量高于MW和PW;SW的单宁含量远高于WW。如表3所示,非加强型葡萄酒总硫、游硫、总糖等基本理化指标,均在规定范围之内;典型加强型葡萄酒的总硫都远低于非加强型葡萄酒,游硫为0,也说明酒精对加强型葡萄酒起到主要保护作用。

表3 典型加强型葡萄酒与非加强型葡萄酒的基本理化指标Table 3 Basic physiochemical indices of typical fortified and non-fortified wines

2.2 典型加强型葡萄酒的香气特征感官分析

高糖和高酒精的环境使加强型葡萄酒具有独特的风味和挥发性成分[29]。由图1可知,3种典型加强型葡萄酒(图1-A～图1-C)的整体香气轮廓面积都大于非加强型葡萄酒(图1-D、图1-E),说明具有更加浓郁的香气;典型加强型葡萄酒共同的香气特征以坚果、焦糖、甜香和奶油味为主,均明显高于非加强型葡萄酒,可作为加强型葡萄酒的典型香气特征;SW(图1-A)在典型加强型葡萄酒中的奶油味分值评分较高(6.24分),可作为SW的独特香气特征;PW(图1-C)在典型加强型葡萄酒中的红色水果、青草和薄荷味评分较高,依次为4.11、2.84、2.98分,感官特征与文献的结果一致[6,30];MW(图1-B)的烘烤(7.73分)、坚果(7.42分)、橡木(3.60分)、巧克力(3.49分)、甜香(7.09分)和焦糖味(7.33分)的感官评分较高。3款典型的加强型葡萄酒具有不同的香气特征与不同的原料组成、发酵工艺和陈化过程有关[23];雪梨酒的独特香气特征与发酵过程中酒花的形成有关;波特酒独特的香气特征与发酵工艺及葡萄原料有关;马德拉酒独特的香气特征与加热陈化和橡木桶陈酿有关。非加强型葡萄酒的感官特征与典型加强型葡萄酒明显不同,RW(图1-D)突出的感官特征为红色水果(6.40分)和青草味(2.80分),WW(图1-E)为香蕉(4.00分)、花香(6.52分)和蜂蜜味(5.34分)。加强型葡萄酒独特的感官特征与高酒精和高糖有密切关系,陈化过程中发生的氧化反应、美拉德反应、褐变现象和焦糖化反应等,赋予加强型葡萄酒独特的感官特征[5,28]。

A-雪莉酒感官轮廓图;B-马德拉酒感官轮廓图;C-波特酒感官轮廓图;D-干红葡萄酒感官轮廓图;E-白葡萄酒感官轮廓图图1 典型加强型葡萄酒和非加强型葡萄酒感官轮廓图Fig.1 Sensory profiles of typical fortified and non-fortified wines

2.3 典型加强型葡萄酒的挥发性成分分析

利用Origin 2021软件对15款酒样进行热图分析,探究典型加强型葡萄酒与非加强型葡萄酒的挥发性成分差异。挥发性成分的含量由蓝色到红色依次增加,由图2可以看出不同酒类的挥发性成分存在明显差异。聚类热图将57种挥发性成分聚为4类:第1类挥发性成分在SW和MW中含量较高,包括丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、叶醇等22种物质;第2类挥发性成分在PW中含量较高,包括异丁醇、异戊醇、正己醇等6种物质;第3类和第4类挥发性成分在WW和RW中含量较高,包括乙酸异戊酯、丙醇、乙酸己酯等29种物质。在第1类和第2类挥发性成分中,SW挥发性成分的丰富度明显高于MW和PW,而MW和PW的丰富度基本相同;第3类和第4类挥发性成分在非加强型葡萄酒中含量较高,且WW的挥发性成分丰富度明显高于RW。

图2 典型加强型葡萄酒与非加强型葡萄酒挥发性成分的聚类热图Fig.2 Clustering heatmap of volatile components in typical fortified and non-fortified wines

为了进一步探究典型加强型葡萄酒和非加强型葡萄酒中起主要作用的挥发性成分,故将SW、MW和PW的挥发性成分归为典型加强型葡萄酒,将RW和WW的挥发性成分归为非加强型葡萄酒。采用OAV[31]分析酒样中挥发性成分对主体挥发性成分的贡献,当OAV>1时,说明该挥发性成分对酒的主体挥发性成分有贡献[32]。典型加强型葡萄酒与非加强型葡萄酒中OAV>1的挥发性成分如表4所示,共有27种挥发性成分可作为具有贡献的挥发性成分。典型加强型葡萄酒中OAV>1的有丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、异戊酸乙酯等18种挥发性成分,其中2-甲基丁酸乙酯、异戊酸乙酯、苯乙酸乙酯等9种挥发性成分是典型加强型葡萄酒特有的;非加强型葡萄酒中OAV>1的有丁酸乙酯、正己酸乙酯、月桂酸乙酯等18种挥发性成分,其中月桂酸乙酯、乙酸苯乙酯、3-苯丙酸乙酯等9种挥发性成分是非加强型葡萄酒中特有的。典型加强型葡萄酒和非加强型葡萄酒之间的感官差异可能和特有的挥发性成分有关。

表4 典型加强型葡萄酒与非加强型葡萄酒部分挥发性成分香气活度值Table 4 OAVs of several volatile components in typical fortified and non-fortified wines

根据香气值理论,葡萄酒中挥发性成分含量高阈值低的成分很可能是主要的挥发性成分[36]。结合图2和表4可以看出,在典型加强型葡萄酒中OAV>1且特有的挥发性成分有9种(2-甲基丁酸乙酯、异戊酸乙酯、苯乙酸乙酯、葫芦巴内酯、糖醛、苯甲醛、4-乙基-2-甲氧基苯酚和4-乙基苯酚);除此之外还有9种挥发性成分在典型加强型葡萄酒和非加强型葡萄酒中共有,但含量较高和OAV>1的挥发性成分有3种(丁酸乙酯、苯乙醇和异戊醇)。其中能给典型加强型葡萄酒带来坚果味[7,33-34]的是葫芦巴内酯、异戊醇、糖醛和苯甲醛,带来甜香[7,34-35]的是2-甲基丁酸乙酯、4-乙基苯酚、异戊酸乙酯、苯乙醇和2,4-二叔丁基苯酚,这9种挥发性成分的OAV>1,且含量都高于非加强型葡萄酒,故可视为典型加强型葡萄酒的主要挥发性成分,与之前报道部分一致[37]。因此典型加强型葡萄酒中独特的香气和风味物质与这些主要挥发性成分有关,且都与感官特征具有很高的吻合性。

在非加强型葡萄酒中OAV>1且特有的挥发性成分有9种(月癸酸乙酯、乙酸苯乙酯、3-苯丙酸乙酯、肉桂酸乙酯、乙酸己酯、芳樟醇、庚醇、癸酸和癸醛);除此之外还有9种挥发性成分在典型加强型葡萄酒和非加强型葡萄酒中共有,但含量较高和OAV>1的挥发性成分有6种(正己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸异戊酯、辛酸和大马士酮)。其中能给非加强型葡萄酒带来果香[34]的有正己酸乙酯、月桂酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、肉桂酸乙酯、乙酸己酯和大马士酮,花香[35]的有乙酸苯乙酯、芳樟醇和癸醛,蜂蜜味[7]的有3-苯丙酸乙酯,香蕉味[35]的有乙酸异戊酯,这12种成分的OAV>1,且含量都高于典型加强型葡萄酒,可视为非加强型葡萄酒的主要挥发性成分,与之前的报道具有一致性[30, 32, 38]。

挥发性成分含量和OAV的分析结果确定了典型加强型葡萄酒与非加强型葡萄酒的主要挥发性成分。为了进一步验证这些主要挥发性成分对典型加强型葡萄酒和非加强型葡萄酒的贡献程度,对15款酒样中具有贡献的挥发性成分进行PCA(图3)。

图3 典型加强型葡萄酒与非加强型葡萄酒OAV>1的挥发性成分主成分分析Fig.3 Principal component analysis of volatile components with OAV>1 in typical fortified and non-fortified wines

由图3可知,PC1和PC2的贡献率分别为49.8%和19.2%,累计贡献率为69.0%;同一款酒样的数据点聚集程度相对较好,表明同款酒样的主要挥发性成分存在共性且差异性较小。PW和MW的数据点集中在PC1负向端,RW的数据点集中在PC1的正向端,表明MW和PW与干红葡萄酒中具有贡献的挥发性成分存在差异;SW和WW均位于PC2的正向端,SW主要分布在PC1的负向端,WW主要分布在PC1的正向端,表明2款酒样的挥发性成分存在明显差异;典型加强型葡萄酒整体分布在PC1的负向端,非加强型葡萄酒分布在PC1的正向端。由此说明典型加强型葡萄酒与非加强型葡萄酒的主要挥发性成分的含量和差异较大,同款酒样的差异较小。而这些挥发性成分的差异主要与加强型葡萄酒终止发酵的工艺及不同的葡萄原料有关,使加强型葡萄酒具有独特的挥发性成分。

综合典型加强型葡萄酒与非加强型葡萄酒挥发性成分OAV分析结果和PCA结果,两者挥发性成分的贡献程度存在较大差异,同种酒样的主要挥发性成分的贡献程度差异较小。由此可以确定筛选出的9种挥发性成分是典型加强型葡萄酒的主要挥发性成分,12种成分是非加强型葡萄酒中的主要挥发性成分。

3 结论

雪莉、波特和马德拉酒作为典型的加强型葡萄酒,波特酒具有较深的红色色调,雪莉酒和马德拉酒具有较深的黄色色调;典型加强型葡萄酒具有坚果、焦糖、甜香和奶油等香气特征,其中葫芦巴内酯、异戊醇、糖醛、苯甲醛、2-甲基丁酸乙酯、4-乙基苯酚、异戊酸乙酯、苯乙醇和2,4-二叔丁基苯酚为典型加强型葡萄酒的主要挥发性成分。后续研究还需要进一步在原料保持一致的情况下,通过模拟不同加强型葡萄酒的酿造工艺开发相应产品并验证结果。