张 鹏，郭子雨，冯 缘，吴利雪，梁苡琳，郭金庆，张启翔，孙 明

(花卉种质创新与分子育种北京市重点实验室，国家花卉工程技术研究中心，城乡生态环境北京实验室，园林环境教育部工程研究中心，林木花卉遗传育种教育部重点实验室，北京林业大学 园林学院，北京 100083)

百合（Liliumspp.）是鲜花市场上最常见的切花种类，其品种众多，形态各异，深受消费者的欢迎.在众多的百合品种中，不乏花色艳丽、花香芬芳的品种[1].花香作为植物最重要的观赏性状之一，在百合育种中也经常将花香作为重要的育种目标.植物花香是目前研究的热点，它是由许多低相对分子质量的挥发性有机化合物（volatile organic compound，VOC）组成，植物花香中的主要成分有萜烯类化合物（terpenoids）、苯丙素类/苯环类化合物（phenylpropanoids/benzenoids）和脂肪酸衍生物（fatty acid derivatives），还包括一些含氮或硫的化合物[2].Kong 等[3]对来自7 个不同杂种系的35 个百合品种盛花期花朵进行挥发物成分的测定，结果发现：构成百合花香的主要物质为萜烯类化合物和苯丙素类/苯环类化合物，尤其以单萜类化合物含量最多，含量高的有芳樟醇、(E)-β-罗勒烯、1,8-桉树脑等单萜类化合物，苯甲酸甲酯为百合花香中重要的苯丙素类/苯环类化合物.

关于百合花香合成关键基因的研究也非常热门.张腾旬[4]在‘西伯利亚’百合花瓣中成功克隆出百合单萜合成相关的关键基因1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶（1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase，DXS）基因，命名为LiDXS.萜烯合酶（terpene synthase，TPS）家族的酶类作为萜烯类合成最后步骤的酶，可分别催化二甲基丙烯基焦磷酸（dimethylallyl diphosphate，DMAPP）、香叶基焦磷酸（geranyl diphosphate，GPP）、法尼基焦磷酸（farnesyl diphosphate，FPP）和香叶基香叶基焦磷酸（geranylgeranyl diphosphate，GGPP）形成不同的半萜、单萜、倍半萜和二萜物质[5].Du 等[6]在对几十个品种的百合进行挥发物测定的同时，从众多品种中获得了TPS基因的cDNA 序列并进行后续分析.除了萜烯类之外，苯丙素类/苯环类化合物也是百合花香的主要成分之一，尤其是苯甲酸甲酯，在众多百合品种中均有存在.王欢[7]成功从百合品种‘黄色风暴’（Lilium‘Yelloween’）中克隆出苯甲酸/水杨酸羧基甲基转移酶（benzoic acid/salicylic acid carboxyl methyltransferase，BSMT）基因，取名为LiBSMT，并验证了其功能.此外，一些转录因子也能够参与花香物质的合成，如PAP1能够增加月季的萜烯类挥发物与苯丙素类/苯环类挥发物含量[8]；在百合品种‘西伯利亚’中，LoMYC2会显著影响挥发物的含量[9].

本研究利用顶空固相微萃取（headspace solidphase microextraction，HS-SPME）和气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）联用技术，结合挥发性代谢组学分析方法，对4 种常见切花百合初花期与盛花期花朵的挥发物种类和含量变化进行分析.利用实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）技术对6 个花香合成相关的关键基因进行相对表达量的测定，其中PAL、PAL3和BSMT基因与百合苯丙素类/苯环类挥发物合成相关，DXS、DXR和TPS基因与百合单萜类挥发物合成相关.最后对百合花朵进行中性红染色（neutral red staining）试验，来确定不同品种、不同花期百合花瓣挥发物的释放区域.

1 材料与方法

1.1 试验材料试验材料为4 个品种的百合切花，品种分别为OT 百合（oriental×trumpet hybrids）‘竞争’（Lilium‘Competition’）、OT 百合‘木门’（Lilium‘Conca d'Or’）、东方百合（oriental hybrids）‘索邦’（Lilium‘Sorbonne’）和东方百合‘西伯利亚’（Lilium‘Siberia’），切花购自北京东风国际花卉市场.购回的切花进行瓶插复水，置于光照培养箱内，温度25±1 ℃，相对湿度55%，16 h 光照和8 h 黑暗处理.复水后，采用初花期和盛花期花朵进行试验，初花期和盛花期的花朵形态如图1 所示.

图1 4 个百合品种在2 个开放时期的花朵形态Fig.1 The flower morphology of four lily varieties during two blooming periods

1.2 试验方法

1.2.1 花朵挥发物的收集与分析 花朵挥发物的收集采用顶空固相微萃取方法进行.萃取前先将萃取头插入气相色谱仪进样口，在250 ℃下老化10 min（新萃取头需老化2 h）.将百合花朵称重后立刻放入2.4 L 玻璃器皿中，随后在玻璃器皿内壁加入5 μL 内标溶液后密封（内标物质为癸酸乙酯，用甲醇配成1∶1 000 内标溶液），室温平衡10 min.然后将萃取针插入瓶中，推出萃取头，萃取30 min.30 min 过后缩回萃取头，将萃取头插入气相色谱仪进样口，在250 ℃下解析5 min.之后注入样品进行GC-MS 分析，4 个品种、2 个花期的花朵挥发物测定做3 次生物学重复.

化合物定性方法：采用GCMS Postrun Analysis 软件进行分析，利用NIST 11 质谱库进行检索，结合资料分析、文献查阅，确定化合物种类.

化合物定量方法：根据化合物峰面积与内标物质峰面积来计算化合物含量，计算公式如下.

化合物定性和定量工作完成后，要对化合物进行进一步的筛选，去掉与质谱库匹配相似度低的化合物（一般保留相似度大于80%的化合物），同时去掉含量极低的化合物和硅氧烷类化合物（硅氧烷类化合物一般为萃取头的主要成分，不是花香的主要成分），其余数据用作后续分析[10].

1.2.2 不同花期6 个花香合成关键基因相对表达量测定 以初花期和盛花期百合内轮花瓣为材料，分别对3 个苯丙素类/苯环类花香物质合成相关的关键基因PAL、PAL3、BSMT和单萜合成相关的关键基因DXS、DXR、TPS进行qRT-PCR 验证.苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia lyase，PAL）是苯丙烷类物质代谢途径中最重要的限速酶，是进入苯丙烷类代谢途径的第1 种酶[11-13]，有研究表明PAL基因的表达会显著影响苯甲酸甲酯的生物生成[14-15].苯甲酸/水杨酸羧基甲基转移酶（BSMT）可以催化苯甲酸和水杨酸生成苯甲酸甲酯和水杨酸甲酯[16-17]，该酶在百合品种‘黄色风暴’和岷江百合（Lilium regale）中得到鉴定[7,18].1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶（DXS）和1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶（1-deoxy-Dxylulose-5-phosphate reductoisomerase，DXR）作为2 种潜在的萜烯类合成途径限速酶，在百合品种‘西伯利亚’中的表达量与萜烯类挥发物趋势是一致的[19].TPS是单萜类化合物合成的关键基因，在百合品种‘西伯利亚’中也得到了鉴定[20].该部分试验中用到的基因均从百合中得到验证.

采用OMEGA 总RNA 提取试剂盒按照说明书提取百合内轮花瓣的总RNA，提取后的总RNA 用琼脂糖凝胶进行电泳分析，并进行反转录.利用DNAMAN 软件进行qRT-PCR 引物设计，引物序列见表1，Actin为内参基因.qRT-PCR 的过程在PikoReal 96 孔荧光定量仪中运行，相对表达量用2-△△Ct法进行计算，设定每个品种、每个基因的qRT-PCR 结果均以初花期为对照，即初花期表达量为1.

表1 实时荧光定量PCR 所用到的引物序列Tab.1 Primer sequences used in qRT-PCR

1.2.3 百合花瓣的中性红染色试验 气味腺（osmophore）是能够产生和释放花朵挥发物的特殊腺体结构，其存在于花器官的特定区域.利用中性红染料可将花瓣内部的气味腺染色，因此中性红染色能够大致确定花瓣可能释放挥发物的部位[21].为观察初花期与盛花期百合花朵的中性红溶液染色情况，本次对百合花瓣进行中性红染色参考胡荻的方法[22]：配制0.01%的中性红自来水溶液，将百合品种‘木门’‘索邦’和‘西伯利亚’初花期和盛花期花朵的花柄进行蜡封后浸入0.01%的中性红自来水溶液中，黑暗环境下染色24 h.由于初花期的花朵并没有完全开放，因此在染色前对初花期花朵的6 片花瓣小心地分离，避免伤到花瓣，之后再进行染色.染色之后用自来水冲洗掉多余的染料，晾干后对染色后的花朵进行拍照观察.

1.2.4 数据分析及绘图所用到的软件 利用迈维代谢云平台（https://cloud.metware.cn）进行维恩图、PCA 分析（principal components analysis）图、聚类热图的绘制和差异挥发物的筛选.利用GraphPad Prism 8 软件进行qRT-PCR 柱状图结果的绘制.利用IBM SPSS Statistics 22 软件进行挥发物分类饼图的制作；利用Adobe Photoshop CS6 软件对植物材料图片和其它结果图片进行编辑.

2 结果与分析

2.1 百合花朵挥发物成分与含量统计4 个百合品种初花期与盛花期花朵的挥发物成分与含量统计结果如表2 所示，共检测到61 种挥发性化合物.61 种挥发性化合物在4 个品种不同花期的含量热图如图2 所示.4 个品种无论是初花期还是盛花期，花朵中的萜烯类挥发物质含量均很高，尤其在盛花期，萜烯类挥发物质的含量比初花期更多.在初花期与盛花期花朵中，含量较高的成分有芳樟醇、(Z)-β-罗勒烯、桉树脑、(+)-柠檬烯、月桂烯等单萜类挥发物，以及苯甲酸甲酯、苯甲酸乙酯、水杨酸甲酯、(E)-异丁子香酚等苯丙素类/苯环类化合物，尤其以芳樟醇和(Z)-β-罗勒烯的含量最为丰富，水杨酸甲酯在百合品种‘木门’中含量较为丰富，而(Z)-β-罗勒烯、苯甲酸甲酯、(+)-柠檬烯、月桂烯和惕各酸甲酯这些物质在4 个品种初花期与盛花期花朵中均能检测到.

表2 4 个百合品种初花期和盛花期挥发性物质成分及含量Tab.2 Components and contents of volatiles in early flowering stage and full blooming stage of 4 lily cultivars (ng·g-1·h-1)

图2 4 个品种初花期与盛花期挥发物含量热图Fig.2 Heat map of volatile contents in early flowering stage and full blooming stage of 4 cultivars

根据4 个百合品种初花期与盛花期花朵挥发物成分与含量统计结果绘制维恩图，如图3 所示.初花期与盛花期花朵共检测到61 种化合物，从初花期花朵中共检测到45 种化合物，从盛花期花朵中共检测到51 种化合物，初花期与盛花期花朵同时检测到的化合物有35 种.4 个品种初花期花朵同时检测到的化合物有6 种，4 个品种盛花期花朵同时检测到的化合物有7 种.

图3 百合花朵初花期与盛花期挥发物数量维恩图Fig.3 Venn diagram of the amount of volatiles in early flowering stage and full blooming stage of lily flowers

2.2 百合花朵挥发物含量的PCA 分析利用4个百合品种初花期与盛花期花朵挥发物含量进行PCA 分析，结果如图4 所示.每个品种不同花期的结果重复性良好，其中4 个品种的初花期结果较为紧凑地靠在一起，可能是初花期花朵在每个品种中的挥发物种类与含量都是较低的，而且有些种类的挥发物可能是4 个品种在初花期共有的.与初花期挥发物不同的是，4 个品种的盛花期结果差异较大，东方百合品种‘索邦’和‘西伯利亚’与OT 百合品种‘竞争’和‘木门’在盛花期的挥发物含量上存在明显差异.4 个品种初花期挥发物含量与4 个品种盛花期挥发物含量也有明显差异.

图4 4 个品种初花期与盛花期挥发物含量的PCA 分析Fig.4 PCA analysis of volatile contents in early flowering stage and full blooming stage of 4 cultivars

2.3 百合花朵差异挥发物的筛选正交偏最小二乘法判别分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）是一种有监督模式识别的多元统计分析方法，该方法可最大程度找出数据集内部不同组别之间的差异，结合代谢物的信息，从而筛选出差异显著的代谢物[23].OPLS-DA 分析中的变量重要性投影（variable importancein projection，VIP）经常用于筛选差异代谢物[24].本文中，利用VIP 值和P值（pvalue）共同筛选差异挥发物，仅在同一品种的初花期和盛花期进行筛选，筛选条件为VIP 值大于1 且P值小于0.05，分别从‘竞争’‘木门’‘索邦’和‘西伯利亚’的初花期和盛花期花朵挥发物中筛选出22、14、18、11 种差异挥发物.共筛选出44 种差异挥发物，差异挥发物情况如表2所示.

2.4 百合花朵挥发物种类分类对61 种挥发性化合物进行分类，共分为9 类，即萜烯类、芳香族化合物、脂肪烃类、醇类、醛类、酮类、酯类、含氮化合物和其它.各类挥发物在不同品种初花期与盛花期的占比如图5 和表3 所示.由结果可以得出：4 个品种初花期主要成分为萜烯类和酯类物质，其中品种‘竞争’和‘索邦’初花期花朵中的萜烯类物质占比最大；品种‘木门’和‘西伯利亚’中的酯类物质占比最大；‘西伯利亚’初花期花朵的萜烯类与酯类含量相近.4 个品种的盛花期花朵全部都是萜烯类物质最多，其次为酯类、芳香族化合物等.

表3 4 种百合初花期与盛花期挥发物分类及含量统计Tab.3 Classification and content statistics of volatiles from early flowering stage and full blooming stage of 4 lily cultivars（ng·g-1·h-1）

图5 4 个品种初花期与盛花期花朵挥发物分类Fig.5 Classification of volatile compounds in the flowers of four varieties during the early flowering stage and full blooming stage

2.5 百合花香合成关键基因的qRT-PCR 结果为了验证不同花期百合花香物质合成关键基因的相对表达量，对4 个品种初花期与盛花期花朵的6个花香物质合成关键基因进行qRT-PCR 验证.结果如图6 所示，根据qRT-PCR 结果可以看出：PAL、PAL3、DXS和TPS这4 个基因盛花期的表达量在4 个品种中均高于初花期，这与对应时期的单萜类和苯丙素类/苯环类化合物释放量趋势一致；而BSMT基因在盛花期‘西伯利亚’百合中的表达量却远远低于初花期；DXR基因在盛花期‘竞争’和‘木门’中的表达量也低于初花期.实际上，4 个百合品种盛花期的苯甲酸甲酯和单萜类化合物的释放量都要远高于初花期.

图6 6 个花香合成关键基因的qRT-PCR 结果Fig.6 qRT-PCR results of 6 key genes for floral synthesis

2.6 百合花瓣中性红染色试验结果对百合品种‘木门’‘索邦’和‘西伯利亚’初花期和盛花期花朵进行中性红溶液染色，并将内轮花瓣摘下进行拍照，观察染色情况，结果如图7 所示.结果表明3 个品种初花期与盛花期花瓣上均有不同程度的染色，且盛花期花瓣染色深度深于初花期.初花期花朵染色区域较小，盛花期花朵染色区域较大，两个时期的花瓣均在上半部反卷处染色较深，而百合品种‘索邦’的花瓣在上半部反卷处的染色深度与其它位置相差不明显，可能是因为‘索邦’花朵本身的粉色导致的结果.

3 讨论

3.1 百合花朵挥发物定性与定量结果分析通过对4 个百合品种初花期与盛花期花朵挥发物定性与定量分析，结合众多文献对百合花朵挥发物进行测定，认为4 种百合主要花香成分为单萜和苯丙素类/苯环类挥发物质，且盛花期挥发物的总含量要高于初花期.从百合花朵的成分分类来看，无论是初花期还是盛花期，萜烯类挥发物都是主要成分.在初花期，除了萜烯类物质，‘木门’和‘西伯利亚’品种还含有较多的酯类物质，其中相当一部分属于苯丙素类，例如苯甲酸甲酯、苯甲酸乙酯、水杨酸甲酯等.而到了盛花期，单萜类挥发物的含量占比最高，其次是酯类和芳香族化合物，这些花香成分成为百合盛花期的主要成分.由于每个品种2 个花期的花朵挥发物测定仅做了3 次生物学重复，导致有些挥发物成分在某些重复样品中并未检测到，此时应该增加生物学重复的次数.

3.2 百合花香合成关键基因的qRT-PCR 结果分析根据对PAL、PAL3、BSMT、DXS、DXR、TPS这6 个花香合成关键基因的qRT-PCR 试验结果，发现这些基因大多都在盛花期表达量最高，这也呼应了不同时期花朵的挥发物定量试验的结果，即这些基因在盛花期高度表达，从而促进了花香物质的合成.另外，在百合品种‘西伯利亚’中，初花期的BSMT基因表达量高于盛花期，这个结果是与其它3 个品种不同的.根据初花期与盛花期的苯甲酸甲酯含量来看，苯甲酸甲酯的含量趋势与相对表达量的趋势是相反的，原因可能是该BSMT基因并不是‘西伯利亚’生成苯甲酸甲酯的主要基因.BSMT基因能够催化苯甲酸和水杨酸生成苯甲酸甲酯和水杨酸甲酯，本文中BSMT的qRT-PCR 引物来自于百合品种‘黄色风暴’[7].还有一些酶如苯甲酸羧基甲基转移酶BAMT 和水杨酸羧基甲基转移酶SAMT 可以分别催化苯甲酸和水杨酸生成苯甲酸甲酯和水杨酸甲酯[25-26]，这2 个基因均属于SABATH 家族的基因[27].也有研究表明：在姜花（Hedychium coronarium）中同时存在HcBSMT1与HcBSMT2基因，可分别催化苯甲酸和水杨酸形成苯甲酸甲酯和水杨酸甲酯[17].另外的原因也可能是苯丙烷类物质代谢途径重要基因PAL在‘西伯利亚’盛花期的高表达（PAL在‘西伯利亚’盛花期表达量约为初花期的200 倍，如图6 所示），导致其催化生成的产物增多，间接地促进了‘西伯利亚’苯甲酸甲酯的生物合成，因此才会有‘西伯利亚’中盛花期的苯甲酸甲酯含量高于初花期的结果.另外，DXR基因在百合品种‘竞争’和‘木门’中，盛花期的表达量低于初花期，但萜烯类物质的释放量却在盛花期最高，这两个结论也是矛盾的，原因可能是因为DXR与DXS和TPS相比，并不是萜烯类合成途径的限速酶.目前很多研究都证明了DXS为萜烯类合成的关键限速酶，对萜烯类的合成至关重要[28-29].TPS的转录活性也对萜烯类化合物的产生有重大影响[30].关于DXR基因，与本文类似的结论也出现在对宽叶薰衣草（Lavandula latifolia）DXR基因的功能研究中[31].

3.3 百合花瓣的中性红染色试验结果分析由于品种‘竞争’花朵颜色较深，不宜对其进行中性红染色，因此仅对‘木门’‘索邦’和‘西伯利亚’3 个品种进行中性红染色试验.试验结果表明，在中性红染色后，同一品种在不同花期的百合花瓣显示明显的染色差异.盛花期的染色程度高于初花期，并且两者均在花瓣的上半部反卷处呈现最深的染色情况.这说明3 个百合品种在盛花期的气味腺分布区域要大于相应品种的初花期.此外，不论是初花期还是盛花期，花瓣的上半部反卷处都是气味腺最为密集的区域，大量气味腺集中在该部位，表明这一区域是主要的挥发物释放区域.大量气味腺存在该部位可能有利于花香物质的散发.以上规律在中性红染色结果中尤其明显体现在百合品种‘西伯利亚’上.‘西伯利亚’百合花朵呈白色，在从初花期到盛花期的过程中，花瓣的颜色变化很小.因此，可以排除花瓣颜色深浅与花瓣固有颜色等因素对试验结果的影响.相比之下，‘索邦’的花瓣主要呈粉红色，并且随着开放程度的增加，花瓣的颜色深度也会增强.因此，使用‘索邦’百合进行中性红染色试验的结果会受到自身条件的影响.尽管‘木门’花朵主要呈黄色，但根据染色试验结果，得出的结论仍然与‘西伯利亚’百合类似.