李运超,薛雅儒,杨羽琪,郑 杰,闻正顺,郑 斌

(浙江海洋大学食品与药学学院,浙江舟山 316022)

辣木(MoringaoleiferaLam.),别名鼓槌树,是多年生热带乔木。辣木起源于热带的印度,在当地有着“奇迹之树”的美誉[1]。辣木的根、茎、叶、果实都具有丰富的营养物质,其中以辣木叶营养含量最为丰富,2012年辣木叶被我国批准为新资源食物。辣木叶中含有多种多样的营养物质和生物活性成分[2],在印度作为基础食品和传统药材。辣木叶还具有极大的商业潜力,目前已经应用于食品[3]、畜牧业[4],应用于医疗业[5-9]和保健品[10]市场有巨大前景。辣木叶的活性成分众多,蛋白质、多糖、黄酮类[11]等有较好的抗氧化活性。但辣木叶中的天然低聚糖还没有被开发利用,在提取辣木多糖的同时往往被弃除掉。低聚糖作为一种肠道益生菌的营养物质,无法被消化吸收,但可以作为益生元[12-13]供给肠道菌群,有益于身体健康。目前国内关于辣木叶低聚糖的研究鲜见报道。

低聚糖的提取方法包括水提法、酶解法、超声波辅助法等。Zhai等[14]用水提法提取三七低聚糖,发现其可以抑制细胞复制性衰老;嵇威等[15]用木聚糖酶解玉米秸秆制备低聚糖,提取率达到59.24%;郭泽镔等[16]用微波辅助法提取莲子低聚糖,该提取工艺低聚糖得率达到10.525%。该研究以辣木叶为原料,用热水浸提法提取辣木叶中的天然低聚糖成分;使用苯酚硫酸法测定其低聚糖含量,通过单因素试验探究各个因素对提取液中低聚糖含量的影响,再进一步通过响应面分析,综合各因素分析得到提取辣木叶低聚糖的最优工艺条件,为辣木叶低聚糖活性研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1试材。无水乙醇(20170413)、三氯甲烷(191108558F)、正丁醇(20210508)、硫酸(10021618)、苯酚试剂(20171020)均为分析纯,来自国药集团化学试剂有限公司;辣木叶,采购自北京金日丰科贸有限责任公司。

1.1.2仪器。HH-W600数显三用恒温水箱,金坛市医疗仪器厂;TDZ5-WS台式低速离心机,长沙湘智离心机仪器有限公司;90-2定时恒温磁力搅拌器,上海精科实业有限公司;MULTISKAN GO 酶标仪,赛默飞世尔科技(中国)有限公司;FD-1E 冷冻干燥机,北京德天佑科技发展有限公司;N-100 旋转蒸发仪,上海保玲仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1辣木叶低聚糖的提取流程。辣木叶干燥后粉碎,过60目筛,得到辣木叶粉末。称取50 g辣木叶粉末,加入1 500 mL 水,70 ℃水浴加热30 min,过滤后得上清液。上清液通过旋转蒸发仪减压浓缩至400 mL,倒入100 mL的Sevage试剂(三氯甲烷∶正丁醇=4∶1)脱蛋白,600 r/min磁力搅拌1 h,4 000 r/min离心15 min取上清,重复操作至无蛋白析出。再次通过旋转蒸发仪来减压浓缩,60 ℃旋蒸30 min去除残留的Sevage试剂并浓缩糖溶液。糖溶液中加入无水乙醇调至含乙醇量80%,加乙醇时不断搅动溶液,4 ℃保存24 h,离心弃除多糖沉淀,上清液浓缩后冷冻干燥,即得到辣木叶低聚糖。

1.2.2标准曲线的绘制。将葡萄糖干燥,称取0.01 g葡萄糖,加10 mL水溶解,配制成1 mg/mL的葡萄糖溶液,分别吸取40、80、120、160、200 μL葡萄糖标准品溶液于试管中,不足200 μL的加水补齐至200 μL,向试管中分别加入100 μL苯酚、300 μL浓硫酸,之后放入85 ℃水浴锅加热15 min,在室温下冷却,于490 nm处测定吸光度。以标准液浓度为横坐标、对应的吸光度为纵坐标绘制标准曲线(图1)。

图1 葡萄糖标准曲线Fig.1 Standard curve of glucose

1.2.3糖溶液的配制及含量测定。

1.2.3.1辣木叶总糖溶液的配制。辣木叶经过烘干后粉碎,过60目筛,称取1 g辣木叶粉末,加适量水,70 ℃水浴加热3 min,得到总糖溶液。

1.2.3.2辣木叶多糖溶液的配制。吸取1 mL总糖溶液至10 mL 离心管,加入5 mL无水乙醇,充分摇匀后放入4 ℃离心机内静置1 h,随后4 000 r/min离心10 min,弃除上清液,并用80%乙醇润洗沉淀,之后沉淀加1 mL水溶解,得到多糖溶液。

1.2.3.3辣木叶总糖含量测定。将“1.2.3.1”步骤中总糖溶液稀释至10倍,利用苯酚硫酸法测定总糖含量。

1.2.3.4辣木叶多糖含量测定。利用苯酚硫酸法,测定“1.2.3.2”步骤多糖溶液中的多糖含量。

1.2.3.5辣木叶低聚糖含量。总糖含量减去多糖含量即为低聚糖含量[17]。

1.2.4单因素试验。

1.2.4.1提取温度对辣木叶低聚糖含量的影响。设置料液比为1∶30(g∶mL)、提取时间30 min,研究一定梯度内温度(50、60、70、80、90 ℃)对辣木叶低聚糖含量的影响。

1.2.4.2料液比对辣木叶低聚糖含量的影响。设定温度 70 ℃、提取时间 30 min,改变料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、 1∶50、1∶60)研究其变化对辣木叶低聚糖含量的影响。

1.2.4.3提取时间对辣木叶低聚糖含量的影响。在确定料液比1∶30、提取温度 70 ℃时,改变提取时间(15、30、45、60、90、120 min),研究提取时间对辣木叶低聚糖含量的影响。

1.2.5响应面试验。根据单因素试验设置合适梯度的提取温度(A)、料液比(B)和提取时间(C),使用Design-Expert 8.0 软件进行响应面试验,其因素和水平见表1。通过交叉作用探究其中各因素对低聚糖含量的影响程度,方便在提取过程中更好地控制低聚糖含量稳定。

表1 响应面试验因素水平

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1料液比对辣木叶低聚糖含量的影响。从图2可以看出,料液比对辣木叶低聚糖含量的影响呈现先上升后下降的趋势,在料液比1∶30时辣木叶低聚糖含量最佳。在料液比不足1∶30时,水作为媒介用量不足以让辣木叶粉末中的低聚糖全部溶出;所以,在确定1∶30为最佳料液比的情况下,选择与其相邻的1∶20和1∶40为响应面试验考察因素。

图2 料液比对辣木叶低聚糖含量的影响Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on oligosaccharide content from Moringa oleifera leaf

2.1.2提取时间对辣木叶低聚糖含量的影响。从图3可以看出,短时间的加热使辣木叶低聚糖含量达到顶峰,之后出现断崖式的下降。辣木叶低聚糖含量在提取时间为30 min时达到最大值。这可能是辣木叶低聚糖提取过程中,低聚糖不断溶出伴随其他杂质的溶出,杂质增多的情况下使得低聚糖的溶出量降低[18],导致低聚糖含量下降。所以,选择提取时间为15、30、45 min为响应面试验考察因素。

图3 提取时间对辣木叶低聚糖含量的影响Fig.3 Effect of extraction time on oligosaccharide content from Moringa oleifera leaf

2.1.3提取温度对辣木叶低聚糖含量的影响。从图4可以看出,在50～90 ℃,温度对辣木叶低聚糖含量的影响呈现出先升后降趋势,且具有一定程度的对称性。这可能是因为温度过高导致了低聚糖的分解。70 ℃为辣木叶低聚糖的最佳提取温度,选择与其相邻的60和80 ℃为响应面试验考察因素。

图4 提取温度对辣木叶低聚糖含量的影响Fig.4 Effect of extraction temperature on oligosaccharide content from Moringa oleifera leaf

2.2 辣木叶低聚糖提取工艺响应面优化试验以提取温度(A)、料液比(B)、提取时间(C)为自变量,低聚糖含量为响应值,根据Box-Benhnken试验设计和结果(表2),得到二次多项回归方程:低聚糖含量=19.084+0.782 50A- 0.578 75B+ 0.728 75C-1.020 0AB-0.925 0AC-0.602 5BC-3.423 25A2-5.060 75B2-5.525 75C2。

表2 Box-Benhnken试验设计和结果

表3 回归模型方差分析

从各因素之间的交互作用的3D响应面图(图5～7)来看,分析2个因素之间的相互影响作用,在其中一个为定量不变时,辣木叶低聚糖含量的变化均随另一个因素呈先增后减波动,但波动程度略有差异。提取温度和料液比的交互作用,提取温度一侧的陡峭程度较料液比高,说明提取温度对交互作用的影响更大,对低聚糖含量的影响也更大;提取温度和提取时间的交互作用,提取温度和提取时间对低聚糖含量的影响大致相同;料液比和提取时间的交互作用,提取时间对低聚糖含量的影响更大,在实际操作中,应关注敏感因素提取温度对工艺的影响。从等高线进行分析,等高线的形状可反映交互效应的强弱,椭圆形表示两因素交互作用显著,而圆形则与之相反,提取温度-料液比和提取温度-提取时间的等高线图都略呈椭圆形,交互作用接近,但料液比-提取时间的等高线图近乎是圆形,两者的相互作用没有显著性。

图5 提取温度-料液比交互作用3D响应面和等高线Fig.5 Effect of extraction temperature-liquid ratio interaction 3D response surface and contour plot

图6 提取温度-提取时间交互作用3D响应面和等高线图Fig.6 Extraction temperature-extraction time interaction 3D response surface and contour plot

图7 提取时间-料液比交互作用3D响应面和等高线图Fig.7 Extraction time-solid-liquid ratio interaction 3D response surface and contour plot

根据Design-Expert 8.0运行结果,辣木叶低聚糖最优提取条件是提取温度71.185 9 ℃、料液比1∶29.268 1、提取时间30.03 min,在此工艺条件下提取液中辣木叶低聚糖含量为19.17 mg/mL。为了方便试验操作,最优提取条件定为提取温度70 ℃、料液比1∶30、提取时间30 min,此工艺条件下提取液中辣木叶低聚糖含量约为19.50 mg/mL。

3 结论与讨论

辣木因其丰富的营养价值和良好的药用效果,逐渐被人们所熟知和关注[2]。低聚糖在保健品等市场有巨大潜力,将辣木叶低聚糖作为功能因子[17-20]纳入保健品能够拓宽辣木叶的销售渠道,提高辣木叶的综合利用价值。所以对辣木叶低聚糖进行开发和利用,提供一种简单且高效提取辣木叶低聚糖工艺具有重要的战略意义。目前对辣木叶低聚糖的研究鲜见报道,辣木叶低聚糖在辣木叶多糖提取过程中往往被丢弃,该研究提供了一种简单高效提取辣木叶低聚糖的方法,在单因素试验的基础上进行响应面分析,根据Design-Expert 8.0运行结果,辣木叶低聚糖最优提取条件为提取温度71.185 9 ℃、料液比1∶29.268 1(g∶mL)、提取时间30.03 min,此时的低聚糖含量为19.17 mg/mL。为了方便试验操作,最优提取条件定为提取温度70 ℃、料液比1∶30、提取时间30 min,试验所提取的低聚糖含量约为19.50 mg/mL,且该低聚糖样品易吸潮,需要覆盖封口膜保存在干燥皿内,以免吸潮影响其质量和活性。该试验用热水浸提法提取辣木叶低聚糖,方法可靠,为之后水提法提取辣木叶低聚糖提供了可靠的方法。在此方法之后,可以尝试使用超声辅助提取和酶解法,进一步探究提取低聚糖的经济高效方法。该研究提取的辣木叶低聚糖纯度还有待提高,后续可经大孔树脂脱色、凝胶色谱柱以及高效液相色谱分离获得更高纯度的低聚糖,利用核磁和质谱技术对其进行结构鉴定,并进一步探究其活性,为辣木叶低聚糖打开销售市场提供技术支持。