孟立霞,王 召,杨 健,朱秀芳

(1.凯里学院,贵州凯里 556011;2.汉江师范学院,湖北十堰 442000)

髭蟾属(Vibrissaphora)隶属两栖纲(Amphibia)无尾目(Anura)角蟾科(Megophryidae),原隶属锄足蟾科(Pelobatidae),为中国特有属。刘承钊等[1]通过形态学特征将髭蟾属划入角蟾科,雄性在繁殖期上唇缘生有角质刺,俗称“角怪”“胡子蛙”。目前已知髭蟾属有峨眉髭蟾(V.boringiiLiu)、崇安髭蟾指名亚种(V.liuiliuiPope)、崇安髭蟾瑶山亚种(V.liuiyaoshanensisLiu and Hu)、雷山髭蟾(V.leishanensisLiu and Hu)、哀牢髭蟾(V.ailaonicaYang,Chen and Ma 1983)、原髭蟾(V.promustacheRao,Wilkinson et Zhang)6个种(或亚种)[2]。雷山髭蟾仅分布于贵州雷公山,分布区域非常狭窄,主要栖息在海拔800 ～2 100 m、植被类型保存完好、溪流水源充足的常绿阔叶林、落叶阔叶林、常绿落叶阔叶混交林、针叶混交林以及针阔混交林下的山间小溪附近[3]。成体一般产卵在林间小溪扁平石块下;卵40 d左右孵出蝌蚪;蝌蚪完成变态过程要越过2个冬天,从卵发育成成体需要3年时间[4]。成蟾多爬行,不善跳跃,行动缓慢,容易遭天敌捕食;其蝌蚪期长,易遭天敌吞食,成活率低。近年来,雷山髭蟾的栖息环境遭到破坏,当地居民大量捕食雷山髭蟾成体、蝌蚪甚至卵,使得雷山髭蟾的数量呈现急剧减少的趋势,面临灭绝的危险。国家林业和草原局、农业农村部公布的2021年2月1日起实施的《国家重点保护野生动物名录》中,雷山髭蟾被列为国家二级重点保护野生动物[5]。

目前已发表有关雷山髭蟾研究论文20多篇,主要关于雷山髭蟾的生物学基本特征[6]、雷山髭蟾成体及幼体的生态环境[3,7-8]、卵群发育[9-10]、种群动态[11]、种群历史[12]、保护与发展[4,13]、繁殖期雷山髭蟾性二态分析及求偶鸣声[14]、微卫星DNA标记[15]、MHC Ⅰ类基因的多态性与进化分析[16]、线粒体全基因组[17]、营养成分分析及评价[18-19]等。目前尚未见到采用多变量形态学分析方法对雷山髭蟾蝌蚪形态特征进行分析的报道。雷山髭蟾是我国特有的珍稀保护动物,关于其生活史方面的研究很少。为了解雷山髭蟾蝌蚪的形态学特征,笔者采用多变量形态学分析方法对雷山髭蟾蝌蚪的全长、体高、尾长、尾高等18项指标进行测量,并对其进行方差分析、主成分分析和聚类分析,分析雷山髭蟾蝌蚪不同全长段间形态特征的差异,了解雷山髭蟾蝌蚪在野外自然状态下的生长发育情况及其适应水生生活的形态特征,旨在为雷山髭蟾蝌蚪的生物学特征积累基础数据。

1 研究方法

1.1 样本的采集2020年12月在雷公山国家级自然保护区内格头村、仙女塘和康利水厂附近的溪流采集雷山髭蟾蝌蚪(图1),采集样本数74只。为减少该研究对雷山髭蟾蝌蚪的影响,对雷山髭蟾蝌蚪体重和形态指标进行测量后及时将其放回溪流,所测量蝌蚪均在自然条件下生长发育。

图1 雷山髭蟾蝌蚪采集地点Fig.1 The collection sites of V. leishanensis tadpoles

1.2 体重和形态指标测量使用电子天平称量雷山髭蟾蝌蚪的体重,精确到0.01 g。使用电子数显卡尺对雷山髭蟾蝌蚪的形态指标进行测量,精确到0.01 mm,共测量全长、吻肛距、尾长、尾高、体宽、体高、上尾鳍高、下尾鳍高、吻出水孔距、眼前头长、吻鼻距、鼻间距、眼径、眼间距、口宽、吻肛距、尾基宽17项形态指标。依据组距式分组法,结合雷山髭蟾蝌蚪全长数据及样本数,以50 mm为组距,将全部样本分为3个组:0～50 mm组的样本有3只(1～3号样本),51～100 mm 组的样本有62只(4～65号样本),101～150 mm组的样本有9只(66～74号样本)。

1.3 数据处理为消除雷山髭蟾蝌蚪个体间异速增长的影响,先使用Excel软件将雷山髭蟾蝌蚪各外部形态指标的原始数据转换为以10为底数的对数值,再使用SPSS 20.0软件进行方差分析、主成分分析和聚类分析。

2 结果与分析

2.1 雷山髭蟾蝌蚪的外部形态雷山髭蟾蝌蚪体形肥大,皮肤光滑,呈红棕色,体尾有小黑点;头部呈淡红色且有少许褐色块斑,尾部具有淡黄色“V”形斑(图2a、c、e),尾鳍半透明,尾肌强壮,尾末端钝尖;吻端平圆,鼻孔近于吻两侧、靠近眼。眼在体前面的背侧;两眼相距较远。口为下位,具有发达的下颌肌及坚硬的锯齿状下颌鞘,唇齿发达。腹部呈灰白色,嘴呈开“W”形(图2b、d、f),盘曲的肠道等清晰可见,肛孔开口于腹部尾基中央。全长0～50 mm组雷山髭蟾蝌蚪的全长41.75～49.63 mm,平均全长45.66 mm;全长51～100 mm组雷山髭蟾蝌蚪全长53.55～99.19 mm,平均全长75.33 mm;全长101～150 mm组雷山髭蟾蝌蚪全长100.44～118.30 mm,平均全长106.73 mm。全长0～50 mm组雷山髭蟾蝌蚪尾部褐色斑点较为集中,且主要集中在基部,且后肢芽均未发育(图2a、b)。全长51～100 mm组和全长101～150 mm组雷山髭蟾蝌蚪褐色斑点分布比较分散,下尾鳍和上尾鳍均有褐色斑点分布(图2c～f)。全长51～100 mm组少部分蝌蚪后肢芽已生长,大部分蝌蚪未生长后肢芽。全长101～150 mm组的全部蝌蚪均具后肢芽,且生长程度不同。雷山髭蟾蝌蚪的四肢先后长出,后肢芽慢慢发育成后肢,后肢长出后再长出前肢。此次采集到的蝌蚪样本不管有无后肢芽,均无前肢。

2.2 雷山髭蟾蝌蚪体重和形态指标分析

2.2.1雷山髭蟾蝌蚪体重和形态指标测量。雷山髭蟾蝌蚪的体重和形态指标见表1。全长0～50 mm组雷山髭蟾蝌蚪均无后肢,全长51～100 mm组雷山髭蟾蝌蚪部分有后肢,全长101～150 mm组雷山髭蟾蝌蚪均有后肢。

表1 雷山髭蟾蝌蚪的体重和外部形态指标

2.2.2方差分析。先将3组雷山髭蟾蝌蚪体重和形态指标的原始数据转换成以10为底数的对数值,再使用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析,结果见表2。由表2可知,雷山髭蟾蝌蚪体重、吻肛距、全长、尾长、尾高、体宽、体高、上尾鳍高、下尾鳍高、吻出水孔距、眼前头长、吻鼻距、鼻间距、眼径、眼间距、口宽、后肢芽长、尾基宽的P值均小于0.01,表明3组雷山髭蟾蝌蚪的18项指标差异均极显著。

表2 方差分析结果

2.2.3主成分分析。先将雷山髭蟾蝌蚪体重和形态指标的原始数据转换成以10为底数的对数值,再进行主成分分析,KMO值接近1(KMO=0.930),Bartlett球度检验的P值小于0.01(P=0.000),表明所测数据适合进行因子分析。从18项指标中提取特征值大于1的主成分有1个(图3),因为这个主成分的累计方差贡献率为76.351%,所以这个主成分保留了原有指标的大部分信息。通过主成分得分系数矩阵(表3)可知,对主成分影响较大的指标为体重(0.965)、全长(0.950)、眼间距(0.928)、体宽(0.907)、尾长(0.918)。

表3 公因子方差

图3 主成分分析碎石图Fig.3 Principal component analysis gravel diagram

主成分的得分值=体重×0.070+吻肛距×0.068+全长×0.071+尾长×0.070+尾高×0.069+体宽×0.070+体高×0.056+上尾鳍高×0.064+下尾鳍高×0.068+吻出水孔距×0.063+眼前头长×0.053+吻鼻距×0.046+鼻间距×0.061+眼径×0.050+眼间距×0.070+口宽×0.061+后肢芽长×0.061+尾基宽×0.069。

2.2.4聚类分析。将雷山髭蟾蝌蚪体重和形态指标的原始数据转换成以10为底数的对数值,再进行聚类分析。采用单个样本进行聚类分析,使用欧氏距离法对体重、全长、眼间距、体宽、尾长等18个指标进行聚类分析,聚类树状图见图4。74只雷山髭蟾蝌蚪共进行73步聚类。以标线5为基准,可分成五大类:5号样本单独为一大类(规定为第二类),1、2、3、4、6、7号样本为一大类(第三类),51、54、55、56为一大类(第四类),57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74号样本为一大类(第五类),其他样本为第一类,第一类样本最多(45个);第一类和第二类聚为一支,再与第三类聚在一起;第四类和第五类聚在一起;前三类和后两类的距离最远。全长0～50 mm组(1～3号样本)与全长101～150 mm组(66～74号样本)的雷山髭蟾蝌蚪关系最远;全长51～100 mm组(4～65号样本)的雷山髭蟾蝌蚪处于生长发育的过渡阶段,与全长0～50 mm组雷山髭蟾蝌蚪有较近的关系,所以较多蝌蚪与该组蝌蚪聚为一类,而较少蝌蚪与全长101～150 mm组雷山髭蟾蝌蚪聚为一类。

图4 雷山髭蟾蝌蚪形态指标聚类分析Fig.4 Cluster analysis of the morphological indices of V. leishanensis tadpoles

3 讨论

蝌蚪的形态结构具有种属特征且能反映行为方式的独特性[20]和栖息地水体质量,蝌蚪的形态结构研究对于两栖类的分类学、系统学、保护学和生态学等研究具有重要价值[21]。雷山髭蟾的生活史具有水栖的蝌蚪期和陆栖的成体期2个阶段,蝌蚪是其生命史中的一个重要时期。通过对雷山髭蟾蝌蚪外部形态指标进行方差分析、主成分分析和聚类分析,可以得到雷山髭蟾蝌蚪外部形态的基础数据和区分的重要形态指标。其体重、吻肛距、全长、尾长、尾高等18项指标均差异极显著,说明不同全长组的雷山髭蟾蝌蚪在形态特征方面存在明显的差异。这与峨眉髭蟾蝌蚪的体形测量与分析结果(体重、体长、尾长等指标均存在极显著差异)相一致[20]。峨眉髭蟾和雷山髭蟾同属于髭蟾属,其蝌蚪的区分特征也相似。主成分1的累计方差贡献率为76.351%;体重、全长、眼间距、体宽、尾长5个指标对主成分的影响较大,说明雷山髭蟾蝌蚪的体重、全长和尾部形态是对其影响较大的指标,对雷山髭蟾蝌蚪的区分起到重要作用,可作为雷山髭蟾蝌蚪区分的重要指标。全长0～50 mm组和全长101～150 mm 组雷山髭蟾蝌蚪形态特征差异较大,所以分别进行聚类;全长51～100 mm组雷山髭蟾蝌蚪为生长发育过渡阶段,与全长0～50 mm组雷山髭蟾蝌蚪形态特征差异较小,所以多数蝌蚪与该组蝌蚪聚为一类。此次调查是在冬季进行的,当年产的卵还未孵化,蝌蚪均为前一两年出生、经历过1个或2个冬季,所以全长0～50 mm组蝌蚪数量很少;全长51～100 mm组的蝌蚪数量最多,多数为经历过1个冬天的蝌蚪,少数为经历过2个冬天的蝌蚪;全长101～150 mm组蝌蚪数量不多,为经历过2个冬天的蝌蚪,此全长组多数蝌蚪已经发育为成体,离开溪流到附近的陆地生活。雷山髭蟾蝌蚪生长发育缓慢,且各时期发育时长不等[7]。同一时期的蝌蚪全长等形态特征相近,不同时期蝌蚪的形态特征差异显著,主要是由长期适应不同环境进化形成的生物学特性决定的[9]。同时,蝌蚪的体形及其他形态特征与所处环境有很大关系[22]。生活在同一区域的蝌蚪因环境相似,多数蝌蚪发育水平相当,全长也相近;在长期的生活史中,可能受蝌蚪密度[20]、甲状腺激素调控[23-24]、水深[20]、食物种类等因素的影响[25],少数蝌蚪发育缓慢,全长明显小于其他蝌蚪。温度对蝌蚪发育时长的影响十分显著,可能是因为蝌蚪的生长发育受体内酶的影响,而温度会影响酶的活性[26-27]。生活在不同区域的蝌蚪受温度影响较大。样本采集地格头村与仙女塘和康利水厂相距约15.5 km,两地海拔不同(格头村海拔1 015 m,仙女塘和康利水厂海拔1 600 m)。海拔高的地区气温和水温相对较低,水温低则蝌蚪发育慢,水温高则蝌蚪发育快。水温的不同会导致同一期卵孵化的蝌蚪发育水平不同,蝌蚪大小等形态特征不同,这些差异反映了蝌蚪形态结构对生境适应的可塑性[20]。

雷山髭蟾蝌蚪外部形态分析可为雷山髭蟾的生物学特征研究积累基础数据,为髭蟾属的物种分化研究提供基本信息。在没有鉴定蝌蚪分期的情况下,该研究依据雷山髭蟾蝌蚪的全长将其分为3组,并对蝌蚪形态进行分析。目前有关雷山髭蟾蝌蚪研究的报道很少,对其分期的精确划分尚属空白,而分期对雷山髭蟾蝌蚪种群的研究具有重要意义。Gosner分期法通过蝌蚪后肢和趾的形态变化来界定蝌蚪的标准形态分化程度,很多研究者质疑其可靠性[28]。由于此次调查在冬季进行,未能了解其他时期蝌蚪的发育状况。建议今后进行为期3年的跟踪调查,并结合雷山髭蟾蝌蚪的全长、体重等指标[29],采用常用的Gosner分期法对雷山髭蟾蝌蚪进行分期,以全面了解雷山髭蟾蝌蚪的生长发育情况。