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基于低剪切力微流控芯片的细菌长期动态培养及抑菌监测研究

2023-10-08张雅丽王雪靓刘翔赵磊高建华王德富牛颜冰李毅申少斐

分析化学 2023年9期
关键词:微流剪切力菌液

张雅丽 王雪靓 刘翔 赵磊 高建华 王德富 牛颜冰李毅 申少斐

1(山西农业大学生命科学学院, 中兽医药现代化山西省重点实验室, 太谷 030801)

2(西安电子科技大学生命科学技术学院, 西安 710126)

抗菌药物在治疗感染性疾病、防治动物疫病以及保障公共卫生安全方面发挥了其它药物不可替代的作用。但是,抗菌药物滥用引起的细菌耐药已经成为全球性的公共卫生问题[1]。为方便对抗菌药物进行研究,研究者设计了多种抗菌药物药敏性方法。传统抗菌药物药敏实验主要包括全基因测序、质谱法、聚合酶链式反应(PCR)、肉汤稀释法、纸片扩散法和E-实验等[2-6],但也各有不足,如E-实验和纸片扩散法需要肉眼观察菌落的形成或者测量抑菌圈的大小,进而判断药物的抑菌效果,难免会存在误差;并且这些实验方法涉及繁琐的实验操作,耗时长,通常需24~48 h,成本高。此外,当全基因检测接近检测极限时,继续提高测序深度反而可能会引入低频率的假阳性突变。同时,随着耐药病原体的增多和耐药机制的变异,传统药敏实验逐渐无法满足临床快速诊治的需求[7]。因此,开发微型化、集成化、智能化和可在线监测的生物传感器尤为重要。

近年来,利用微流控芯片对细菌进行培养和药敏实验是新兴的研究方向。微流控技术已被广泛应用于生物学领域,其具有体积小、自动化、高通量和精确的流体控制等特点[8-10]。微流体中最常用的材料是聚二甲基硅氧烷(PDMS),其优点是易于微加工和成本低廉,表面具有良好的生物相容性。此外,PDMS 还具有高弹性和透气性,这对于密封微通道中细胞的长期培养至关重要。与传统的培养皿相比,PDMS 芯片能够提供更加可控的微环境,因此在细菌培养方面具有广阔的应用前景[11-15]。使用PDMS 芯片进行实验可以明显缩短检测时间,并且能够采用显微镜实时检测药物的抑菌作用。此外,PDMS 芯片具有良好的封闭性能,在进行前期的保护工作后,可有效避免杂菌污染。细菌培养室连接细菌与相邻的微通道,连续供应营养并去除代谢物,以实现细菌在芯片中的长期动态培养。长期动态培养不仅能使细菌进入培养室后适应动态的生存条件,更好地模拟体内肠道环境,还可使更多的药物与细菌接触,从而更真实地反映药物的实际抑菌作用[16]。基于PDMS 的微流控芯片的这些独特优势推动了各种用于细菌测试的微流控芯片的开发,为抗菌药物敏感性实验(AST)和耐药菌株耐药反应的研究提供了技术支持[17]。Zhang 等[18]利用梯度微流控芯片和质谱技术,探究了超广谱β-内酰胺酶大肠杆菌等耐药细菌在氨苄青霉素和头孢曲松钠作用下成丝状变化的过程。Zhang 等[19]开发了一种基于3D 打印技术的新型微流控芯片,用于检测大肠杆菌对临床代表性抗生素氨苄西林、氯霉素和卡那霉素的抗敏性,该芯片可在5 h 内快速完成药敏实验,进一步证明了微流控芯片在细菌AST 方面具有良好的应用前景。然而,这些实验均未进行灌注细菌后的长期动态培养,无法体现出细菌进入培养室后的生存状态;同时,也无法反映后续细菌与药物作用的真实情况。此外,在长期动态培养过程中,细菌会承受一定的流体剪切力,导致细菌流失或受损。因此,构建低剪切力的细菌培养环境非常重要,而有关研究目前鲜有报道。

本研究组前期工作表明,结构独特的惯性微流控芯片可有效降低流体/细胞操控对流量的依赖[20-23]。在此基础上,优化了微流控装置用于评估绿原酸(Chlorogenic acid,CHA)的抑菌作用。CHA 具有广谱的抑菌作用,对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌等均具有显著的抑制作用[24-25]。本研究设计了一种基于涡旋流的低剪切力微流控芯片,用于高效捕获细菌。此芯片采用独特的微柱结构,实现了更高效的细菌捕获,并最大限度地减少了剪切力对微室中细菌生长的影响。同时,通过控制流速,可以对转导GFP 的大肠杆菌TAc-IeGFP 进行数小时动态培养,采用此微流控芯片观察了3 mg/mL CHA 溶液的抑菌活性。为了得到更可靠的实验结果,采用传统的肉汤稀释法和纸片扩散法,并通过测量吸光度值(OD600)和抑菌圈大小对CHA 最小抑菌浓度(Minimal inhibitory concentration,MIC)及抑菌效果进行了测定和表征。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

2X2-2 型真空泵和DHG 型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司);SW-CJ-2F 型双人双面净化工作台(苏州净化设备有限公司);JA2003 型电子天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司);KW-4 型匀胶机(中国科学院微电子中心研究部)。

75%乙醇溶液(河北康济药械有限公司);PDMS(RTV615,美国Momentive 公司);琼脂(B.R.级,北京索莱宝生物科技有限公司);三氯(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)硅烷(西格玛奥德里奇上海贸易有限公司);胰蛋白胨和酵母提取物(B.R.级,北京奥博星生物技术有限责任公司);CHA(质量分数>98%,合肥凯米克生化科技有限公司)。

1.2 微流控芯片的设计

本研究采用AutoCAD 软件设计了一种低剪切力微流控芯片,用于细菌培养。此芯片包括1 个微室和2 个微柱结构,进口管道设有多个过滤柱,微室入口处设有十字形遮挡柱,微室与主管道中的柱形区域交错排列(图1A)。主管道宽500 μm, 微室为近圆形的正多边形结构(直径为300 μm)(图1B 和1C)。微室用于细菌培养,微柱用于高流速灌注状态下形成涡漩流,保证菌液尽可能进入微室。微流控装置有2 个入口和2 个出口,分别用于注射原溶液和排出废液等。进口管道中的过滤柱可去除一些杂质。柱状结构设计在主管道与微室之间,以最大程度地减少剪切力对微室中细菌生长的影响,并使细菌能够在微室中稳定地生长和反应。

图1 微流控芯片构造图:(A) 细菌捕获及培养的功能单元的图示;(B) 微柱结构和微室(即细菌培养室);(C) 微室进口十字形遮挡柱放大图Fig.1 Configuration of the microfluidic device: (A) Schematic diagram of functional units for capturing and culturing bacteria;(B)Microcolumn structure and microchamber(bacteria culture chamber);(C)Enlarged image of cross-shaped occluded column before the entrance of the microchamber

1.3 微流控芯片的制作方法

微流控芯片装置主要由流动层、薄的PDMS 层和玻璃载玻片组成(图2)。具体制作方法如下:(1)模具加工 硅片清洗后,取15 mL 阴性光刻胶SU-8 2025 置于硅片正中央,并用旋转涂膜仪甩涂硅片,将甩涂好的硅片分别进行前烘、曝光、后烘及显影,最后在正置显微镜下进行观察,检查无误后备用;(2)模子预处理 用TMSCl 蒸气熏模子3 min, 以利于PDMS 聚合物与模子剥离;(3)配制PDMS 以一定质量比例称取PDMS 预聚物和固化剂,并将其混匀;(4)脱气和固化 将上述混合均匀的PDMS 混合物倾倒至模子上,抽真空脱气并放置在一定温度烘箱中加热固化;(5)切割和打孔 将固化好的PDMS 按设计的芯片结构切割、打孔,清理干净;(6)PDMS 微流控芯片的封接 将准备好的PDMS 芯片平整地放置在载玻片PDMS 薄膜上,置于烘箱中烘烤,使其牢固键合。

图2 聚二甲基硅氧烷(PDMS)芯片制作示意图Fig.2 Schematic diagram of fabrication of polydimethylsiloxane (PDMS) chip

1.4 菌种活化及培养

采用GFP 转导的大肠杆菌TAc-IeGFP[26]进行所有的细菌实验,该大肠杆菌发出绿色荧光,方便在荧光显微镜下观察。将-80 ℃冻存的大肠杆菌TAc-IeGFP 取出,常温解冻后,在制备的液态LB 培养基中进行活化,而后均匀地涂布于固体LB 培养基上。将涂布的培养平板置于37 ℃恒温培养箱中培养至出现单菌落;在无菌环境下,将平板上的单菌落接种至EP 管(含液体LB 培养基),并于37 ℃摇床中进行振荡(180 r/min)培养至适宜浓度后,封管保藏。在灌注细菌之前对大肠杆菌进行培养,在无菌环境下取700 μL 贮存在EP 管中的菌液加至100 mL LB 液体培养基中,振荡培养,并测量其在600 nm 处的吸光度值(设多组重复),绘制此大肠杆菌的生长曲线,选取培养12 h 进入稳定期的菌液进行实验。繁殖后的菌液放置时间不得超过7 d, 此时大肠杆菌已进入衰退期,活力下降,不适合进行实验。

1.5 大肠杆菌在微流控芯片中的培养

在无菌环境中组装微流控实验平台。采用无菌注射器吸取75%酒精后与芯片组装,用酒精对芯片进行简单消毒,除去杂物;再用超纯水对芯片进行清洗,并除去芯片中的酒精;最后在紫外光下对芯片进行灭菌。分别在进口2 设置低流速(3 μL/min)灌注细菌和进口1 设置高流速(500 μL/min)灌注LB 培养基,持续10 min 后降低流速,使大肠杆菌稳定在培养室中。随后进口1 更换注射器灌注LB 培养基,设置流速为3 μL/min, 将芯片包裹好后置于37 ℃恒温培养箱中,培养过夜。最后在荧光显微镜下观察大肠杆菌的生长情况,在相同照射间隔(通常为15 min)与曝光时间(通常为3 s)的条件下,拍摄一系列相同微室的荧光图片,用于研究细菌菌落生长情况。通过Image-Pro Plus 6.0(IPP,Media Cyternetics,Lilver Spring,MD)软件分析图像。假设细菌总数正比于此区域的总体荧光强度[27],并将微室图片内部所有像素的总和减去背景值作为荧光强度值。通过Origin 2021(OriginLab Corporation,Northampton,MA)软件进行荧光量化分析。培养一定时间,待大肠杆菌在芯片中完全长开,铺满整个芯片,在荧光显微镜下能观察到稳定的荧光,即培养成功,可进行下一步实验。

1.6 CHA对芯片中培养的大肠杆菌的抑菌效果

将经过一段时间培养已在芯片中稳定生长的大肠杆菌和CHA 药物准备就绪,分别用2.5 和10 mL 注射器吸取适量CHA 与微流控芯片相连;同时,为防止光照对CHA 产生影响,在注射器外部包裹一层锡箔纸。将芯片包裹好后放入37 ℃培养箱内,设置灌注CHA(浓度为3 mg/mL)的流速为3 μL/min,进行大肠杆菌的抑菌实验。每间隔一定时间,在显微镜下观察并做拍照记录。

1.7 CHA对大肠杆菌MIC的测定

利用肉汤稀释法检测不同浓度CHA 标准品溶液对大肠杆菌TAc-IeGFP 的抑菌效果,本实验检测周期为16 h, 具体步骤如下:(1)培养大肠杆菌TAc-IeGFP(挑单菌落接种于5 mL 试管),置于37 ℃培养箱中180 r/min 振荡培养4~6 h 后,分别吸取1 mL 菌液加入到3 个1.5 mL EP 管中,备用;(2)配制CHA 标准品原液(4 mL, 10 mg/mL), 微孔滤膜过滤除菌,然后用LB 培养基稀释至不同浓度(8.75、7.50、6.25、5.00、3.75、2.50 和1.25 mg/mL);(3)取150 μL 做96 孔板抑菌实验,每个孔加OD600=0.5~0.6 的菌液(3 μL,按2%的接种量),每个梯度均做3 组重复;(4)将96 孔板封好,于37 ℃培养箱中避光培养,间隔一定时间使用酶标仪测量其600 nm 处的吸光度(OD600),将所得数据绘制成大肠杆菌TAc-IeGFP 的生长曲线,进而确定CHA 溶液的MIC(当OD600= 0.1 时,细菌悬液的浓度视为1×108CFU/mL)[28]。

1.8 不同浓度CHA溶液对大肠杆菌的抑菌效果

采用纸片扩散法进行琼脂平板上的抑菌圈实验,用记号笔和直尺在琼脂平板培养皿的背面划分3 个区间,分别标记为实验组(1.25~10 mg/mL CHA 溶液)、阳性对照组(50 mg/mL 硫酸卡那霉素溶液)和阴性对照组(50 mg/mL 氨苄青霉素溶液),用打孔器将滤纸片裁剪为直径0.7 mm 的小圆片,将灭菌的滤纸圆片放置在涂布有实验菌液的LB 琼脂平板表面,将滤纸片分别置于划分的3 个区域,随后在对应的滤纸片上滴加5 μL 的实验组及对照组药品,将琼脂平板用透气性封口膜封好,于37 ℃恒温培养箱中倒置培养24 h 后,观察抑菌圈。

2 结果与讨论

2.1 不同流速条件下微流控芯片通道内的迪恩流探究

在不同流速条件下,通道内形成的迪恩流场不同,对于溶液的扩散和粒子的捕获会产生差异。本研究在进口1 分别采用500 和3 μL/min 灌注流速,进口2 采用3 μL/min 灌注流速进行灌注实验。其中,高流速(500 μL/min)用于在微柱之间产生涡旋流以实现细菌捕获,低流速(3 μL/min)则用于灌注培养基和药物。图3 模拟了不同流速下通道内的涡旋流分布,以及管道与微室之间的分子扩散情况。如图3A 所示,在高流速(500 μL/min)条件下,微柱之间会产生涡旋流,将细菌悬液注入微室时,可逐步将细菌挤压到微室内,从而在较短的时间内提高细菌的捕获率。如图3B 所示,在低流速(3 μL/min)条件下,不会出现涡旋流,微柱之间以及培养室之间的流速基本为零,微室中的细菌不会受到液流剪切力的影响,即不会受到物理伤害。因此,本研究选择在低流速(3 μL/min)条件下灌注培养基或药物,并模拟其在微室中的扩散情况(图4)。模拟结果发现,在15 s 内,液流由主管道进入,65 s 后主管道开始逐渐充满,255 s 时微室中的液流扩散至1/2,1000 s 时液流已充满整个培养室。这表明在低剪切力条件下,培养基和药物能够得到充分灌注。此模拟结果为后续在低剪切力条件下对细菌动态培养的长期监测提供了理论基础和验证策略。此外,降低流速可以延长药物的作用时间,减缓对大肠杆菌的作用速度,以便在更长的时间内观察到更多的细节变化。微柱结构的长度不能无限制增加,至少物质扩散时间应少于细菌分裂一代所需的时间。根据小分子(如氨基酸和蔗糖)扩散公式(t=L2/D,t为扩散时间,L为扩散距离,D为扩散常数(3×10-6~1×10-5cm2/s[29])),在主管道与微室之间,物质交换的时间为200~800 s, 与模拟结果基本一致。

图3 不同流速下培养室的数值模拟图:500 μL/min(A)和3 μL/min(B)灌注流速下通道内涡旋流的分布情况(黑色箭头代表捕获室内的细菌运动轨迹;白色箭头代表小培养室内细菌的运动轨迹)Fig.3 Numerical simulation diagram of culture chamber at different flow rates: Vortex flow distribution in the channel at different operation flow rates of 500 μL/min(A) and 3 μL/min (B) (Black arrows represent the trajectories of bacteria captured in chamber;white arrow represents the trajectory of bacteria in culture chamber)

图4 流速为3 μL/min 时药物的扩散效果模拟示意图Fig.4 Schematic diagram of diffusion simulation of drug at a flow rate of 3 μL/min

2.2 大肠杆菌的培养

本研究在完成单克隆大肠杆菌TAc-IeGFP(E.coliTAc-IeGFP)菌液的制备后,绘制了荧光大肠杆菌的生长曲线(图5),在0~27 h 内,对菌液的光密度进行了记录(重复4 组)。由图5 可知,生长阶段大致分为4 个阶段:从开始培养到2 h 为潜伏期,生长缓慢;从2 h 到12 h, 细菌生长处于指数期,细菌浓度呈直线增长的时间约为2 h;12 h 到24 h, 细菌生长处于平衡期,细菌浓度保持在一个稳定的水平;从24 h开始,细菌浓度略有下降的趋势,细菌生长进入衰亡期。在可控差异范围内,4 条曲线的趋势及菌液光密度无明显差异。为了减小因菌密度变化导致的荧光强度误差,本实验在灌注时选用培养12 h 处于稳定期的菌液,使实验结果更可靠。

图5 大肠杆菌TAc-IeGFP 的生长曲线图Fig.5 Growth curve of Escherichia coli (E. coli) TAc-IeGFP

2.3 大肠杆菌在芯片中的长期动态培养

文献[30]表明,采用60 μL/min 的流速实现单细胞聚焦,有利于保持细胞的原始形态。本研究参照计算机模拟结果,选择在500 μL/min 流速下灌注OD600=0.5 的菌液,在3 μL/min 流速下灌注培养基和药物。虽然500 μL/min 的流速偏高,但持续时间较短,在进口处未观察到剪切力对细菌造成伤害,菌液和药物也均可在培养室周围均匀分布。另外,菌液可在10 min 内完成灌注,灌注时间和灌注效果明显优于文献[18,31]。由图6A 和6B 中0 h 时的数据可知,芯片内接种细菌后,菌密度相对较小。在灌注后采用低流速(3 μL/min)动态灌注LB 液体培养基,以保证在不影响芯片内细菌生长条件和位置的前提下,对细菌进行基本营养物质的补充和代谢废物的排出。动态培养72 h 时,菌群已充满整个培养室并纵向叠加排布,呈现出较强的荧光信号。这表明此培养芯片可以满足动态培养细菌、筛选药物和高通量富集等实验需求。进一步对大肠杆菌在芯片中的繁殖过程进行了荧光量化分析,由图6C 可见,经过长期动态培养后,大肠杆菌长势良好。24 h 时培养室入口细菌分布最密集,而动态培养72 h 后,培养室中间的细菌密度和活性均最高。上述结果进一步证明本研究构建的低剪切力微流控芯片可进行细菌的长期动态培养,为后续CHA 的抑菌实验研究奠定了基础。

图6 大肠杆菌TAc-IeGFP 在微流控芯片中分别培养0、24 和72 h 后的(A)明场图、(B)倒置荧光显微镜下的荧光图和(C)荧光量化分析图Fig.6 (A) Bright-field images, (B) fluorescence images under inverted fluorescence microscope and(C)quantitative analysis of fluorescence image of E.coli TAc-IeGFP in microfluidic chips after incubation for 0,24 and 72 h, respectively

2.4 CHA在芯片中对大肠杆菌的抑菌作用

本研究采用微流控芯片平台,利用荧光强度的变化评估荧光标记的大肠杆菌的生长状况[32],并考察了3 mg/mL CHA 对其中培养的大肠杆菌的抑菌作用。结果如图7 所示,与CHA 作用2 h 左右,处于培养室进口边缘区域的大肠杆菌的绿色荧光强度下降,表明其生长受到抑制;与CHA 作用4 h,培养室内的大肠杆菌绿色荧光强度继续下降,说明CHA 持续抑制其生长;与CHA 作用6 h,培养室内的大肠杆菌荧光已非常微弱,表明其生长已被完全抑制;再经过约0.5 h,培养室内绿色荧光全部消失。结果表明,CHA 在6.5 h 左右能够完全抑制大肠杆菌TAc-IeGFP 的生长。大肠杆菌的荧光强度逐步降低,说明CHA对其生长具有持续的抑制作用。

图7 绿原酸(CHA,3 mg/mL)作用2、4、6 和6.5 h 后对大肠杆菌TAc-IeGFP 的抑菌效果:(A)明场图;(B)倒置荧光显微镜下的荧光图;(C)荧光量化分析图Fig.7 Antibacterial effect of chlorogenic acid (CHA) after incubation with E.coli TAc-IeGFP for 2, 4, 6 and 6.5 h, respectively: (A) Bright field image; (B) Fluorescence image under inverted fluorescence microscope;(C) Quantitative analysis of fluorescence image

2.5 传统方法与芯片检测CHA抑菌效果的对比研究

作为对照实验,采用传统的肉汤稀释法和纸片扩散法检测了不同浓度CHA 对大肠杆菌的抑菌效果。利用肉汤稀释法可以大致确定CHA 的MIC,依次将不同浓度的CHA 溶液以及培养至稳定期的菌液加入96 孔板,37 ℃恒温培养箱静态培养,每间隔2 h,通过酶标仪测其OD600值,用于定量分析细菌种群,使用前在培养管中生长时,OD600=0.5(经多次独立重复实验发现在2 h 时600 nm 处的吸光度值变化不显著,而在4 h 时测得的吸光度值变化显著,因此选择培养4 h 后的吸光度值)。实验结果表明,一定浓度的CHA 能够显著抑制大肠杆菌TAc-IeGFP 的生长,并且抑制作用随CHA 浓度增加而增强,CHA 在该稀释梯度下的MIC 大致在2.5~3.75 mg/mL 之间(图8),与文献[32]的结果一致。但该方法与微流控芯片法相比,需要在标准的96 孔板中使用繁琐的稀释步骤,并且非常耗时。

图8 大肠杆菌TAC-leGF 暴露在不同浓度CHA 中的生长曲线Fig.8 Growth curves of E.coli TAc-IeGFP exposed to different concentrations of CHA

采用纸片扩散法研究不同浓度的CHA 标准品溶液对大肠杆菌的抑菌效果,如图9 所示,CHA 浓度为1.25~10 mg/mL 时,未表现出抑菌效果。因此,采用微流控芯片研究CHA 的抑菌效果具有更高的灵敏度和更短的实验时间。Jain 等[33]也得出了类似的实验结果。研究表明,不同的药敏性实验结果存在差异,这进一步表明纸片扩散法用于药敏性检测时评价结果具有不准确性,宏观和微观形态学观察存在差异。因此,运用微流控技术进行药敏性检测具有独特的优势。

图9 大肠杆菌TAc-IeGFP 在琼脂板上与不同浓度的CHA(1.25~10 mg/mL)、硫酸卡那霉素(Kana)和氨苄青霉素(Amp)培养24 h 后的抑菌圈图像Fig.9 Images of E.coli TAc-IeGFP inhibition zone on culture plates after incubation with different concentrations of CHA (1.25-10 mg/ml), kanamycin (Kana) and ampicillin (Amp) for 24 h

3 结论

本研究设计的低剪切力微流控芯片能够在高流速下产生涡旋流,对大肠杆菌进行高效捕获和培养。当液流处于低流速时,其低剪切力不会对微室中捕获的细菌产生扰动,因此适合长期动态培养及给药观察。利用流动的液体培养基对大肠杆菌进行培养,能更好地模拟大肠杆菌在体内的生长环境,使实验结果更具真实性。在荧光显微镜下,通过微流控芯片观察不同时间段内大肠杆菌的整体数量和荧光强度的变化,从微观角度更直观和具体地分析药物的抑菌作用。此外,通过传统抑菌方法研究了CHA 对大肠杆菌TAc-IeGFP 的抑菌作用。相较于传统实验,利用微流控芯片研究药物的抑菌作用具有更多的优势。首先,微流控芯片提高了结果的准确性,缩短了检测时间,可在约6.5 h 内完成药敏性检测。此外,传统抑菌实验耗费人力和材料,造成资源浪费。因此,利用微流控芯片进行抑菌实验具有良好的发展前景。

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