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裂解多糖单加氧酶活性检测方法的研究进展

2023-10-08沈洁如王素英张宏宇娄婷婷乔晨曦

分析化学 2023年9期
关键词:比色法寡糖底物

沈洁如 王素英 张宏宇 娄婷婷 乔晨曦

1(天津商业大学生物技术与食品科学学院, 天津市食品生物技术重点实验室, 天津 300134)

2(天津海关动植物与食品检测中心, 天津 300461)

纤维素和几丁质是自然界中储量居第一位和第二位的生物质资源,分别以葡萄糖和N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)为单体,通过β-1,4 糖苷键连接而成的直链高聚物[1-3]。一直以来,这类结晶态多糖的降解和利用是实验室和工业领域研究的热点和难点[4-6]。因纤维素和几丁质的分子内部及分子间存在氢键,可形成高度有序的结晶态结构,限制了糖苷水解酶的可及性[7-8],阻碍多糖结晶区域的有效降解[9]。然而,具有氧化裂解纤维素和几丁质等结晶区域特性的裂解多糖单加氧酶(Lytic polysaccharide monooxygenases,LPMOs)的发现,为顽固多糖降解提供了新的方向[10-14],在生物质转化和生物燃料工业等方面具有广阔的应用前景[15-16]。

在碳水化合物活性酶数据库(www.cazy.org)中,LPMOs 归为辅助活性家族(Auxiliary activity family,AA),目前已有AA9~11 和AA13~16 共7 个家族,其中,AA9 和AA10 家族的LPMOs 研究比较深入[17-20]。AA9 家族的LPMOs 主要源于真菌,作用于纤维素[21-22]、可溶性纤维寡糖[23]、木聚糖[24]、半纤维素[25]和淀粉[26]等底物。AA10 家族的LPMOs 主要源于细菌,具有纤维素、几丁质、木聚糖以及甘露聚糖降解活性[10,14,27-28]。为探索各家族LPMOs 的酶学特性及其催化机理,对LPMOs 活性的检测至关重要。目前,LPMOs 活性的检测方法逐渐多样化,主要包括色谱-质谱法、比色法和荧光探针标记法等。其中,色谱-质谱法因其灵敏度高、可对反应产物进行定性和定量分析等特点,为解析LPMOs 催化机制提供了重要手段[21,29-31];比色法通过测定底物或产物的浓度,与酶活力建立量效关系,进而表征LPMOs 活性,常应用于突变体的快速高通量筛选[3];荧光探针标记法利用荧光探针对多糖底物进行标记,通过测定荧光值表征LPMOs 活性[32]。以上方法虽存在一定的局限性,但都有其适用范围,而各方法的有机结合可为LPMOs 的新酶开发、催化机制研究及酶工程中突变体的快速筛选等提供有力的技术支撑,从而实现LPMOs 在工业化生物质转化中的应用。

有关LPMOs 活性检测的综述报道有许多[3-4,33],但重点集中在LPMOs 结构、催化机制、家族分类和底物特异性等方面的总结与评述,对检测方法的论述较少。本文评述了近5 年LPMOs 活性检测方法的研究进展,重点对色谱-质谱联用法、比色法和荧光探针标记法等的基本原理及其在LPMOs 活性检测中的应用进行了梳理,总结了LPMOs 活性检测方法的优缺点及适用范围,并对其未来发展趋势进行了展望。

1 基于色谱-质谱联用法检测LPMOs氧化产物

色谱-质谱联用法是基于样品的保留时间、碎片离子和峰面积分析其种类并计算含量,从而达到测定酶活力的目的[34]。不同催化活性的LPMOs 借助O2(或H2O2)和电子,从多糖链C1 或C4 位置获取氢原子使之羟基化,导致糖苷键断裂和多糖链端氧化[23,35],产生不同类型的氧化产物。如具有纤维素活性的LPMOs 可以催化C1 或C4 位,也可以同时氧化二者[32,36]产生C1 位的醛糖酸和C4 位的4-醛基酮糖[3,10,22],几丁质活性的LPMOs 氧化C1 位生成醛糖酸内酯,并水合形成醛糖酸[10,36-37](图1)。对不同类型的产物进行识别和量化所用的色谱-质谱法不同。目前,常用于检测LPMOs 活性的色谱-质谱联用法主要包括高效阴离子交换色谱-脉冲电流检测法(High-performance anion-exchange chromatography-pulsed amperometric detector,HPAEC-PAD)、亲水作用液相色谱-质谱法(Hydrophilic interaction liquid chromatography-mass spectrometry,HILIC-MS)、多孔石墨化碳色谱-质谱法(Porous graphitized carbon chromatography-mass spectrometry,PGC-MS)和超高效液相色谱-质谱法(Ultra high performance liquid chromatography-mass spectrometry,UHPLC-MS)等,各检测方法可测定产物的分子量范围及优缺点见表1。

表1 色谱-质谱联用法在LPMOs活性检测中的应用Table1 Application of chromatography-mass spectrometry in detection of LPMOs activities

图1 裂解多糖单加氧酶(LPMOs)氧化裂解纤维素和几丁质的机理及其产物的形成:(A)LPMOs 催化机理[30]; (B)纤维素氧化裂解产物[32]; (C)几丁质氧化裂解产物[10,37]Fig.1 Mechanism of oxidative cracking of cellulose and chitin by lytic polysaccharide monooxygenases(LPMOs) and the products: (A) Catalytic mechanism of LPMOs[30]; (B) Products of cellulose oxidated[32];(C) Products of chitin oxidated[10,37]

1.1 HPAEC-PAD方法

HPAEC 主要用于纤维素氧化产物糖醛酸的分析[10,29],其中,在检测低聚合度产物时PAD 的灵敏度高于CAD[29]。通过HPAEC-PAD 分离纤维素降解产物,最先被分离出的是非氧化产物,其次是C1 和C4 氧化产物,最后是C1/C4 双氧化产物[46](图2)。在碱性条件下,C1 氧化产物因带负电而被分离和检测[40]。Westereng 等[40]通过HPAEC-PAD 耦合ESI-MS 检测了ScLPMO10C 的C1 氧化产物,由于C4 氧化产物在碱性条件下易发生化学修饰和互变异构[23,47],使质谱无法检测到相应的分子质量。在可溶性产物的检测中,HPAEC-PAD 测定氧化寡糖的检出限(Limit of detection,LOD)可达0.09~0.40 ng/injection,寡糖的LOD 值为0.34~0.66 ng/injection[29]。因检测不溶性产物存在局限性,使测得的LPMOs 整体活性低于真实值[3]。Cannella 等[48]通过水解酶处理LPMOs 催化反应后的产物,测定葡萄糖和葡糖酸的含量,并计算被氧化纤维素的总量,间接测定不溶性产物的含量。Frommhagen 等[24]采用相同的方法测定不溶物含量,得出在反应初期不溶性物所含的氧化寡糖的量高于可溶性部分。然而,通过此方式水解不溶性产物再进行分析时,耗时较长且标准品不易获得,影响LPMOs 活性检测的准确性。因此,该方法仅限于可溶性产物的分析。

图2 不同来源的LPMOs 作用于纤维素的氧化裂解产物[46]Fig.2 Oxidative cracking products of cellulose by LPMOs from different sources[46]

1.2 HILIC-MS方法

HILIC 常作为中性寡糖的分析方法,如几丁质降解产物[29,49]。Vaaje-Kolstad 等[10]通过HILIC 和MALDI-TOF-MS 联用分析了源于粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)的CBP21 催化几丁质的反应产物壳寡糖,并解析了CBP21 的催化机理。依据壳寡糖与几丁-醛酸pH 值的不同,前者在中性流动相(乙腈-水)中保持稳定,后者因带电荷,可通过增加离子强度调节洗脱液的pH 值实现壳寡糖和几丁-醛酸的分离[50]。Westereng 等[29]通过碱性条件电离醛酸以及高强度离子洗脱液平衡电荷消除互斥效应,并在70%乙腈条件下,用HILIC 法检测氧化寡糖的LOD 值范围为33~113 ng/injection。由于PAD 的准确性易受乙腈影响,因此CAD 常与HILIC-MS 结合检测。然而,该方法在分析聚合度大于4 的寡糖和氧化寡糖时,其解析效果较差[29],可通过升高柱温来提高HILIC 色谱的分离效果以及改善峰形,并且能防止寡糖发生异构分离现象。

1.3 PGC-MS方法

鉴于上述C4 氧化产物检测的局限性,Westereng 等[40]结合HILIC(WAX 柱)和PGC 分离出C1 和C4氧化产物,根据样品的极性特征,利用石墨色谱柱实现了纤维寡糖和氧化寡糖的分离[51]。因醛糖酸和非氧化产物的电离常数(pKa)值不同,在PGC 色谱分离过程中,弱碱性条件(pH 8)的流动相使醛糖酸带负电(纤维二糖酸pKa=3.51[40]和D-葡萄糖酸pKa=3.7)[3,29]。基于此,Westereng 等[29]成功获得了醛糖酸的分离条件以及相同聚合度的裂解产物的分离,如4-乙二醇醛糖和醛糖酸。对有相同保留时间的非氧化产物、C4 纤维糊精或醛酸及双氧化产物,可通过质谱分析或者β-葡萄糖苷酶水解产物再次检测[40]。PGC-MS 和CAD 可直接兼容,并在低离子浓度的洗脱液下对C4-纤维寡糖进行定量分析,其LOD 可低至45~66 ng/injection,满足动力学研究的要求[40]。然而,该方法存在一定的局限性,由于PGC 固定相对长链寡糖有强亲和力,即使在高洗脱强度下,聚合度>5 的中性纤维低聚糖也不能被洗脱[29],因此PGC 色谱只能分析聚合度≤5 的寡糖。

1.4 UHPLC-MS方法

Silva 等[31]将UHPLC(HILIC 柱)与ESI-MS 联用检测聚合度为1~5 的寡糖,结合基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)进一步分析了聚合度在3~10 之间的寡糖[42],获得了完整的产物谱。然而,在质谱分析中,LPMOs 反应产物中氧化寡糖和寡糖的质量差为m/z16,与钠和钾加合物的质量差一致,而钠和钾加合物在大多数实验条件下存在,从而在质谱分析中会产生m/z值重叠,而MALDI-TOF MS 的分辨率可达40000,可以区分具有重叠m/z值的化合物[50]。因此,MALDI-TOF MS 常作为一种定性评估LPMOs 氧化产物的分析方法[10,21,38,42-45,50],目前已成功分析了具有几丁质活性[10,52-53]、半纤维素活性[25,54]和淀粉活性[26]的LPMOs。此外,MALDI-TOF 还可以间接评估LPMOs 的底物特异性。Jensen 等[37]在探究底物特异性时将具有几丁质活性的ScLPMO10C 突变为具有纤维素活性的LPMOs,借助UHPLC 和MALDI-TOF MS 测定了可溶性壳寡糖的含量,以表征ScLPMO10C 突变前后的氧化活性。

1.5 RP-UHPLC-MS方法

RP-UHPLC 分析LPMOs 氧化产物的应用较少。Frommhagen 等[41]利用还原性的标记物2-氨基苯甲酰胺(2-AB)与C4 氧化寡糖标记,结合RP-UHPLC 成功分离了C4 寡糖。然而,寡糖的还原端与荧光团-胺复合物反应过程中形成的中间体不稳定,因此Frommhagen 等[41]在不添加强还原剂的情况下,采用非缓冲洗脱液成功鉴定了寡糖和C4 氧化寡糖。该方法补充了C4 氧化产物的分析方法,相对于PGC 方法,其优点是改进了对纤维寡糖和C4 氧化寡糖的分析和鉴定[3],并因使用了非缓冲洗脱液,对质谱灵敏度的影响较小。

在色谱-质谱联用法中,HPAEC-PAD 是LPMOs 活性检测方法中灵敏度最高的方法,可以分析聚合度较高的氧化产物,但不能与质谱法直接兼容。与HPAEC-PAD 相比,HILIC 和PGC-LC 可与质谱法直接兼容从而实现高灵敏度分析。可以利用HPAEC-PAD 结合ESI-MS 分析C1 氧化产物[10,29]以及PGC 和CAD分离解析C4 氧化产物[40],两者结合可以获得纤维素产物谱信息。几丁质氧化产物常以HILIC 结合MALDI-TOF MS 进行分析,从而表征LPMOs 活性[42]。在新酶挖掘及酶学特性的研究中,色谱-质谱联用法仍是可靠的分析方法。

2 基于比色法的LPMOs活性的快速测定

色谱-质谱联用法虽具有高灵敏度的特点,但其仪器设备昂贵,使用范围受限。因此,开发快速、简便的LPMOs 活性检测方法引起了更多的关注。随着LPMOs 研究的不断深入,建立灵敏、快速的酶活检测方法在LPMOs 的工程化改造过程中具有重要意义。因此,基于LPMOs 催化反应特性的比色法得到了快速发展,传统的二硝基水杨酸法、高灵敏度的比色法如镍/邻苯二酚紫分析法、D-葡萄糖酸/D-葡萄糖酸-δ-内酯分析法以及基于H2O2产量的比色法等,被用于快速稳定地检测LPMOs 活性。本节以氧化产物的类型为主线,结合方法应用和LPMOs 活性检测的时间先后顺序,分别基于生成的还原糖产物、C1 氧化产物以及H2O2等对基于比色法的LPMOs 活性检测方法进行阐述。

2.1 二硝基水杨酸法

二硝基水杨酸法(3,5-Dinitrosalicylic acid,DNS)最初用于测定还原糖,通过还原糖与二硝基水杨酸在碱性条件下发生氧化还原反应,并在540 nm 处测定反应产物的吸光度确定还原糖的含量[55]。该方法早期用于LPMOs 的活性测定,通过比较单一水解酶活性和经LPMOs 协同作用的酶活性的差值判定LPMOs 活性。Kim 等[56]结合高效液相色谱法和DNS 法测定了葡萄糖和纤维二糖的含量,从而表征了CgAA9 和纤维素酶的协同作用。该方法操作简单,但表征LPMOs 活性的灵敏度较低。Deshavath 等[55]发现在呋喃糖存在的条件下,测得的还原糖含量远高于实际值,并且未检测到非还原性寡糖。因此,该方法适用于探究LPMOs 的协同作用,而局限于混合产物中单糖的定量分析。

2.2 镍/邻苯二酚紫分析法

Wang 等[57]基于丙烯酸定量检测法开发了镍/邻苯二酚紫分析法用于LPMOs 活性检测。该方法结合C1 氧化产物醛糖酸呈负电荷的特点,并基于邻苯二酚紫(Pyrocatechol violet,PV)与金属阳离子如Cu2+和Ni2+等螯合形成金属离子-PV 复合物在特定波长下有特征吸收,通过测定Ni2+-PV 在650 nm 处的吸光值,达到快速测定LPMOs 活性的目的。该方法还可根据离子吸附/解吸附原理,收集产物与Ni2+共孵育并加入PV,测定上清液中游离的Ni2+含量,从而计算多糖表面产生羧酸根的量。Ni 等[58]应用Ni2+-PV 法检测PcLPMO9D 酶活性时发现高浓度的LPMOs 对纤维素酶有影响。然而,该方法也存在局限性,在检测羧酸根含量时,Ni2+-羧酸不遵循1∶2 的比例结合[57],从而不能精准定量检测醛糖酸。因此,该方法适用于不同家族中LPMOs 活性的比较,以及LPMO 底物特异性的研究。

2.3 D-葡萄糖酸/D-葡萄糖酸-δ-内酯分析法

鉴于LPMOs 催化反应底物形式的单一性,Keller 等[59]开发了一种快速测定微晶纤维素和预处理麦秸中葡萄糖酸的方法。利用糖苷水解酶处理TtLPMO9E 酶解产物,通过D-葡萄糖酸/D-葡萄糖酸-δ-内酯分析试剂盒(D-Gluconic acid/D-Glucono-δ-lactone assay)测定反应产物葡萄糖酸。利用葡萄糖酸激酶、NADP 和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶催化将葡萄糖酸转化为核酮糖-5-磷酸和NADPH,通过测定NADPH 在340 nm 处的吸光值测定LPMOs 活性。该方法测定葡萄糖酸的LOD 值可低至0.27 mg/L,与HPAEC-PAD相比,其灵敏度可以实现对LPMOs 反应产物的定量分析[3,59]。然而,该方法在更改条件时需进行校准,以排除潜在的干扰。

2.4 基于H2O2的量间接检测LPMOs活性

上述检测方法均需借助氧化产物对LPMOs 活性进行定量分析,而根据LPMOs 的催化机理[2],还可通过H2O2的量表征其活性。LPMOs 活性中心的Cu(Ⅱ)被还原成Cu(Ⅰ),与O2结合形成活化的铜-氧复合物,使底物被氧化,进而使糖苷键断裂[10,60],产生氧化产物和水(图3-b)。研究表明,H2O2也作为LPMOs 的动力学相关共底物[61],即Cu(Ⅰ)从底物中获取氢原子并使之羟基化[61-62],进而实现糖苷键断裂(图3-c)。图3 中b 和c 两种催化反应途径是以多糖为底物,其产生的氧化产物通过上述方法可以进行检测[10,61];图3 中的途径a 是在没有多糖底物的条件下,Cu(Ⅰ)与O2反应产生H2O2[2]。目前,通过测定H2O2的量表征LPMOs 活性的方法有传统的Amplex red 过氧化物酶偶联分析法、灵敏的2,6-二甲基苯酚比色法和准确度较高的还原酚酞分析法。

图3 LPMOs 的催化机理:(a) 没有底物的催化反应[2]; (b) O2 为共底物[10]; (c) H2O2 为共底物[61]Fig.3 Catalytic mechanism of LPMOs:(a)No substrate [2]; (b)O2 as co-substrate[10]; (c)H2O2 as co-substrate[61]

2.4.1 Amplex red过氧化物酶偶联分析法

Amplex red 过氧化物酶偶联分析法是经典的测定过氧化物及H2O2的分析方法,在过氧化物酶(HRP)催化下,H2O2与Amplex red 按1∶1 的比例生成红色高荧光的试卤灵(Resorufin)(图4)[63]。通过分光光度法(ε571=58000 L/(mol·cm)或荧光法(λEx/Em=569/585 nm)测定其荧光强度[63],间接测定LPMOs 活性。该方法操作快速,已被广泛用于LPMOs 活性评估和高通量筛选[64]。Mutahir 等[42]利用该方法通过检测H2O2的产率表征了LPMOs 活性。Limsakul 等[28]通过Amplex®Red 过氧化氢/过氧化物酶检测试剂盒测定了LPMOs 活性,H2O2的浓度在0.1~2 μmol/L 范围内与荧光信号响应呈线性关系,并且当LPMOs浓度为5 μmol/L 时,曲线拟合较好(R2=0.99)[63]。然而,该方法只能精准测定浓度在20~574 mg/L 范围内的LPMOs[65],并且其检测环境需要避免金属离子的干扰,如游离Cu2+的存在可能导致假阳性结果[54]。

图4 Amplex red 过氧化物酶偶联法的原理[63]Fig.4 Principle of Amplex red peroxidase-coupled assay[63]

2.4.2 2,6-二甲基苯酚比色法

Breslmayer 等[65,66]开发了2,6-二甲基苯酚(2,6-Dimethoxyphenol,2,6-DMP)比色法,并用于快速评估LPMOs 活性。LPMOs 将两分子的2,6-DMP 氧化为两分子的2,6-DMP 自由基,因自由基不稳定而自发聚合成氢化木酚酮(Hydrocoerulignone),最后经LPMOs 氧化形成显色产物木质素(Coerulignone),根据木质素在469 nm 处的特征吸收峰表征LPMOs 活性(图5)[65]。该方法快速、简便,已被用于裂解纤维素和几丁质的LPMOs 活性测定,以及LPMOs 表达和纯化过程中结合常数或热稳定性的测定[34,67-69]。2,6-DMP比色法定量LPMOs 的浓度可达0.5~50 mg/L[65],与Amplex red 过氧化物酶偶联分析法相比,其灵敏度更高。然而,在酸性缓冲液中,该方法的灵敏度受限。因此,Breslmayr 等[66]在此基础上进行了改进,以氢化木酚酮为底物测定LPMOs 活性。改进后的方法适用于pH 4~8 的缓冲液环境,并且可以进行准确测定。

图5 2,6-二甲氧基苯酚(2,6-DMP)比色法的原理[65]Fig.5 Principle of 2,6-dimethoxyphenol (2,6-DMP) assay[65]

2.4.3 还原酚酞分析法

Brander 等[70]基于Kastle-Meyer 实验原理开发了还原酚酞分析法,并用于LPMOs 活性的快速检测。以H2O2为共底物,通过LPMOs 氧化将无色的还原酚酞(Reduced phenolphthalein,rPHP)氧化成生酚酞(PHP)(图6),通过测定PHP 在552 nm 处的吸光值间接测定LPMOs 的活性,以TaAA9A 为例,其活性检测的LOD 低至15 nmol/L[70]。Brander 等[70]还发现,以脱氢抗坏血酸(DHA)为还原剂时,PHP 更容易定量。然而,抗坏血酸作为还原剂时不能促进rPHP 氧化,反而会引起反应中酶的降解。因此,该分析方法仅限于DHA 的反应中LPMOs 活性评估[70]。与上述两种比色法相比,该方法因rPHP 的高稳定性和耐受性使得LPMOs 活性测定更准确。

图6 还原酚酞分析法的原理[70]Fig.6 Principle of reduced phenolphtalein assay[70]

2.5 偶氮木葡聚糖分析

偶氮木葡聚糖分析法(Azo-Xyloglucan Assay)最初应用于纤维素酶中内切葡聚糖酶[71]的活性检测及木聚糖特异性评估[72]。将可溶性显色底物偶氮木聚糖与染料雷马氏亮蓝(Remazol brilliant blue R,RBBR)混合,利用纤维素酶水解产生染色寡糖,测定染色寡糖在590 nm 处的吸光值表征内切葡聚糖酶的酶活性[72]。基于此,Calderaro 等[3]利用LPMOs 反应中还原剂的作用,通过测定还原剂添加前后上清液颜色变化定量分析LPMOs 的活性。该方法由于缺乏相应的实验数据,尚无法评估其优缺点,因此还未得到广泛应用。

上述比色法均可表征LPMOs 活性,各种比色法灵敏度虽有差异,但在相应的应用范围中能够实现精准测定。如DNS 法的灵敏度虽低但可粗略计算酶活性,广泛用于LPMOs 与水解酶协同作用的活性检测,镍/邻苯二酚紫分析法及D-葡萄糖酸/D-葡萄糖酸-δ-内酯分析法与之相比灵敏度有所提升。在H2O2分析方法中,以Amplex red 过氧化物酶偶联分析法应用范围最广,而2,6-DMP 比色法灵敏度较高。在酶工程改造研究中,比色法可为突变体快速且稳定的筛选提供技术支撑。

3 基于荧光探针标记的LPMOs活性检测

除上述色谱-质谱联用法和比色法之外,还有特异性强的荧光探针标记法,通过测定荧光值表征LPMOs 活性,目前用于LPMOs 活性测定的探针标记主要有以下3 种。

3.1 SYTO-62探针标记

SYTO-62 探针标记法最初是测定聚合物表面的羧基, 经Eibinger 等[12]调整改造后, 用荧光探针SYTO-62 标记纤维素后与LPMOs 共孵育,借助激光共聚焦显微镜连续监测纤维素结晶区域表面的氧化位点, 确定反应产生羧基的量表征LPMOs 活性, 最后证明源于粗糙脉孢菌Neurospora crassa的NcLPMO9F 在催化纤维素裂解时产生了多个氧化位点。

3.2 EDAC荧光标记

EDAC 荧光标记是基于1-乙基-3-[3-(二甲氨基)丙基]碳二亚胺(EDAC)将醛酸活化,再由胺基荧光团7-氨基-1,3-萘二磺酸(ANDA)胺化,形成的共轭产物在450 nm 处具有荧光吸收[73]。Vuong 等[32]通过将水溶性荧光团共价连接到纤维素氧化部位,再与LPMOs 共孵育,测定荧光吸收值反映PcLPMO9D 活性。该方法常用于评估C1 位氧化LPMOs 活性,并与HPAEC 色谱法结合可以获得有关LPMOs 氧化产物的更详细信息。

3.3 ANTS荧光标记

ANTS 荧光标记法是一种基于荧光团8-氨基萘-1,3,6-三磺酸(ANTS)将反应产物胺化而产生还原端,再经聚丙烯酰胺凝胶电泳获得多糖结构的分析方法,即碳水化合物凝胶电泳(PACE)分析法。该方法通过测定探针标记氧化产物的荧光值表征LPMOs 活性,如Quinlan 等[21]利用ANTS 荧光标记并结合MALDI-TOF-MS 分析了源于Thermoascus aurantiacus的TaGH61A 降解纤维素产物,并比较Cu2+对TaGH61A 催化活性的影响。Frandsen 等[74]应用该方法测定了源于Lentinus similis的氧化产物纤维二糖和纤维三糖,表征了LsLPMO9 活性,并测定了酶催化反应的动力学参数。

4 其它方法

除此之外,结合LPMOs 催化反应中电子受体如氧气的消耗量、电子供体如抗坏血酸的消耗量均可以间接测定LPMOs 的催化活性。Gusakov 等[75]基于耗氧率测量的方法,使用带有高灵敏度荧光传感器的Seahorse XFp 分析仪,监测了3 种真菌LPMOs 对无定形区域纤维素的氧化活性。Yu 等[76]利用LPMOs外部电子供体的抗坏血酸的消耗量表征源于Bacillus atrophaeus的BatLPMO10 的活性。此外,根据磷酸溶胀纤维素(PASC)不透明的特征,LPMOs 裂解氧化PASC 使之溶解,通过检测其光密度变化表征LPMOs 活性,Hansson 等[77]利用该特性测定HjLPMO9A 与之突变体氧化裂解纤维素活性,得出HjLPMO9A 突变体对纤维素裂解活性下降50%。

5 结论与展望

LPMOs 氧化裂解产物的组成各异,针对可溶性产物,色谱-质谱法及比色法均可实现精准测定,但在分析不溶性产物时存在局限性。荧光标记法更适于不溶性产物的分析,从而可以实现LPMO 整体活性的检测。随着LPMOs 研究的不断深入,自然界中越来越多的LPMOs 被发现,因此需要发展精确且快速的酶活性测定方法,为其酶学特性的研究提供关键支持。随着计算机辅助设计技术的高速发展,蛋白质工程对LPMOs 的改造将成为研究热点,高通量的LPMOs 活性筛选方法不但可以加速突变体筛选效率,也为LPMOs 的产业化进程奠定了坚实的基础。因此,LPMOs 酶活性的测定方法需要不断地开发和创新,以期研发适用性更广、操作更快速、精度更高的检测方法,为解决当前方法的局限性提供新思路和新途径。

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