陈磊鑫 刘春莹 刘家琴 朱安琪 董钰甜 任艳芸

(1.陕西中医药大学附属医院,陕西 咸阳 712000;2.陕西中医药大学,陕西 咸阳 712046)

肾间质纤维化(Renal interstitial fibrosis,RIF)是多种慢性肾脏病(Chronic kidney disease,CKD)进展至终末期肾病(End-stage renal disease,ESRD)的共同通路,是导致慢性肾功能衰竭进展的病理学基础,RIF是一个多因素参与和多个信号转导通路有关的复杂过程。其中包括核转录因子κB(Nuclear factor κB,NF-κB),作为具有多向性调节作用的核转录因子,调控一系列免疫因子的表达,参与肾小管间质损伤及肾间质纤维化形成过程[1]。作为转录因子家族中的重要成员,NF-κB参与各种炎症细胞因子、趋化因子及促纤维化因子的合成,启动多种细胞因子的转录,从而直接或间接参与肾小管间质纤维化。近年来有研究显示肾小管上皮细胞-间充质转化(Epithelial mesenchymal transition,EMT)是肾间质纤维化的重要机制之一[2],E-cad 是一种特异的黏附分子受体,它对维持肾小管上皮细胞结构和功能的完整性起关键作用,E-钙黏蛋白(E-cadherin,E-cad)异常低表达在EMT过程中发挥着重要作用,促进了肾间质纤维化的进展,随着肾间质损伤不断进展,组织中NF-κB表达呈上调趋势,而E-cad表达则逐渐下降。祛风通络方由乌梢蛇、海风藤、防风、生黄芪、生地、桑寄生等六味药组成,临床常用于治疗多种肾脏病、肾纤维化,通过祛风通络,益气补肾作用降低尿蛋白排泄、降血脂、调控肾纤维化相关蛋白的表达[3]。本文在前期研究的基础上,通过观察5/6肾切除大鼠肾组织中NF-κB及E-cad的表达,进一步探讨该方药对肾间质纤维化的防治作用。

1 材料与仪器

1.1动物 雄性SD大鼠54只,购于西安交通大学动物实验中心,许可证:SCXK(陕)2018-001,于陕西中医药大学动物实验室适应性喂养1周,实验期间各大鼠按标准进食及自由进水,隔日更换垫料。

1.2主要药物及试剂 祛风通络方(乌梢蛇20 g,海风藤10 g,防风10 g,生黄芪30 g,生地20 g,桑寄生20 g)由陕西中医药大学附属医院中药配方颗粒药房提供,制作工艺按照颗粒剂工艺制作,加入温开水配置成低、中、高剂量0.58 g·mL-1、1.16 g·mL-1、2.32 g·mL-1的给药剂量(按照人服用剂量折算大鼠等效剂量)。配制好后放于4 ℃冰箱保存备用。洛汀新(批号 H20000292,北京诺华公司,规格 10 mg/片)。

NF-κB抗体(货号BA1873,武汉博士德生物公司),E-cad抗体(货号BM4166,武汉博士德生物公司);总RNA提取试剂盒(货号RN03,陕西先锋生物公司),CDNA合成试剂盒(货号PC1802,陕西先锋生物公司),qPCR荧光定量试剂盒(货号PC3302,陕西先锋生物公司)。

1.3主要仪器 MIR-262恒温箱(日本木森生物公司);抗体孵育湿盒(武汉博士德生物公司);Q-PCR仪(TL988中国天隆科技);702型超低温冰箱(美国热电公司);BX41奥林巴斯光学显微镜(日本奥林巴斯公司);VELETA G3 CCD;CL-300W制冰机(上海芩隆奥利斯公司);146 bp低温离心机(德国eppendorf 5810);GL3202-1SCN电子精密天平(赛多利斯公司);移液枪(美国Thermo公司);R136型石蜡切片机(德国Leica公司)。

2 方法

2.1模型制备及干预 适应性喂养1周后,将54只大鼠随机分为假手术组9只(A组),造模组45只。其中造模组大鼠腹腔注射10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)麻醉,右侧卧位固定大鼠于固定板,触及左侧肾脏后切开游离左肾脏,切除左肾上、下极各1/3左右肾皮质,明胶海绵止血,然后逐层缝合。9天后再行第二次手术,以同样方式暴露、游离肾脏后,结扎肾蒂,切除完整右肾。假手术组在两次手术中仅分离两侧肾脏外的包膜,不切除肾脏组织。造模成功后,造模大鼠进行分组为模型组(B组)、洛汀新组(C组)、祛风通络方高(D组)、中(E组)、低剂量组(F组),其中A组、B组给予10 mL·kg-1·d-1生理盐水,C组给予洛汀新0.11 g·mL-1,D组给予祛风通络方高剂量、E组给予祛风通络方中剂量、F组给予祛风通络方低剂量,其中所有大鼠用药量均按每100 g灌胃1 mL的剂量,灌胃4周,灌胃期间每周监测各组大鼠体重,根据体重变化灵活调整灌胃药量。

2.2样本采集与指标检测

2.2.1尿液 大鼠处死前1天禁食不禁水,留取24 h尿液,记录总尿量,混匀后取2～3 mL以检测24 h尿蛋白定量。

2.2.2血液 腹主动脉取血3～5 mL,静置30 min后,3000 r/min离心15 min,取血清检测血肌酐、尿素氮。

2.2.3肾组织病理学检查 取部分残肾组织4%甲醛固定,石蜡切片包埋,用于Masson染色,最后光镜下观察肾组织纤维化程度及病理改变情况。

2.2.4免疫组化检测NF-κB、E-cad的表达 切片常规脱蜡至水;灭活:将内源性过氧化物酶阻断剂滴加在组织上,室温孵育 10 min,水洗;抗原修复(微波热修复):先将切片放入 EDTA 抗原修复液,高火加热8 min,冷却8 min后再重复一次,再冷却至室温;封闭:使用5%BSA 封闭液,37 ℃孵育 30 min;进行一抗孵育:实验片滴加一抗(兔抗鼠)多克隆抗体,将一抗NF-κB、E-cad分别与抗体稀释液按1∶200、1∶200混匀,然后滴加覆盖组织,4 ℃过夜,取出后 37 ℃复温 30 min,PBS(pH 7.2～7.6)洗 5 min×3 次进行二抗孵育(羊抗兔):37 ℃ 孵育 30 min。PBS洗 5 min×3 次;SABC孵育:滴加 SABC,37 ℃ 孵育 30 min。PBS洗 5 min×4 次;DAB显色:使用DAB显色液,时刻注意其反应时间;复染:Mayor’苏木素复染色;封片:中性树胶封片;运用免疫组化软件进行半定量分析,从而计算出阳性面积。

2.3Real-time PCR检测NF-κB、E-cad的表达 取约50 mg肾脏组织用组织研磨筛网进行研磨后加入1 mL的裂解液,采用RNAfast1000总RNA提取试剂盒提取肾脏组织总RNA;样品在分光光度计波长为260 nm和280 nm处测定吸收值,用以分析RNA纯度;然后用逆转录试剂盒进行cDNA第一链合成反应,采用qPCR荧光定量试剂盒行实时荧光定量PCR检测肾脏组织中NF-κB、E-cad的表达情况。

引物分别为:NF-κB Forward:5-GCT TCTATGAGGCTGAAC-3,Reverse:5-GGTTATTGTTGGTCTGGAT-3;E-cad:Forward:5-CTCGCTGAACTCCTCTGA-3,Reverse:5-GCCGCCACCATACATATC-3;ACTIN:Forward:5-CTATCGGCAATGAGCGGTTCC-3,Reverse:5-TGTGTTGGCATAGAGGTCTTTACG-3;反应条件95 ℃ 3 min,1个循环;95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s共40个循环,然后计算每个样本的CT值,采用2-ΔΔCt法软件进行相对定量分析。

2.4统计学分析 采用SPSS 22.0统计软件对数据进行分析,符合正态分布的计量数据采用平均值±标准差来说明,组间均数间比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD法,不符合正态分布的数值变量数据经数学变换处理后再行方差分析或t检验,P<0.05有统计学意义,P>0.05无统计学意义。

3 结果

3.1干预后各组大鼠24 h尿蛋白定量及肾功能变化 与A组(假手术组)相比较,B、C、D、E及F组血清肌酐、尿素氮及24 h尿蛋白定量水平均显著升高(P<0.01),其中B组升高最明显;与B组(模型组)比较,各干预治疗组血清肌酐、尿素氮及24 h尿蛋白定量水平均有不同程度降低(P<0.01),见表1。

表1 祛风通络方对5/6肾切除大鼠血肌酐、血尿素氮及24 h尿蛋白定量的影响

3.2干预后各组大鼠肾脏病理形态的改变 肉眼观察,假手术组外观红润、光滑,触之柔软,未见异常肿大;各干预治疗组残肾组织色泽较深,呈暗红色,触之较假手术组硬,肾皮质变薄。Masson染色结果显示假手术组无明显异常病理改变;模型组可见肾小管扩张、萎缩甚至坏死,肾小球基底膜不规则增厚,炎症细胞浸润并可见大量蓝色胶原纤维沉积;各治疗组较B组在肾小管萎缩,肾小球基底膜增厚,炎症细胞浸润及蓝色胶原纤维沉积方面均有不同程度下降。见图1。

3.3RT-PCR法检测肾组织中NF-κB、E-cad mRNA的表达 RT-PCR法检测肾组织中NF-κB mRNA的相对表达结果显示:与A组相比,各组大鼠肾组织中NF-κB mRNA表达明显增多(P<0.01);干预组大鼠肾组织中NF-κB mRNA表达较B组显著降低(P<0.01)结果见图2。RT-PCR法检测肾组织中E-cad蛋白的表达结果显示:与A组相比较,各组大鼠肾组织中E-cad mRNA表达明显减少(P<0.01);各干预组大鼠肾组织中E-cad mRNA表达较B组显著升高(P<0.01)结果见图3。

注：A组:假手术组;B组:模型组;C组:洛汀新组;D组:高剂量组;E组:中剂量组;F组:低剂量组;与A组相比△△P<0.01,与B组相比,**P<0.01

3.4免疫组化检测

3.4.1各肾脏组织中NF-κB的表达及分布 A组少量阳性表达;与A组相比,其余各组阳性表达明显增加(P<0.01),其中以B组阳性表达最强,其阳性表达主要在肾小管上皮细胞,肾间质部位也可见到;C、D、E、F组阳性表达情况较B组有不同程度减少(P<0.01)。如图4、图5。

3.4.2各肾脏组织中E-cad的表达及分布 A组可见强阳性表达,与A组相比较,其余各组阳性表达均有不同程度下降,其中B组阳性表达减少最明显,如图6、图7。

注：A组:假手术组;B组:模型组;C组:洛汀新组;D组:高剂量组;E组:中剂量组;F组:低剂量组;与A组比较△△P<0.01,与B组比较**P<0.01

注:A组:假手术组;B组:模型组;C组:洛汀新组;D组:高剂量组;E组:中剂量组;F组:低剂量组

注:A组:假手术组;B组:模型组;C组:洛汀新组;D组:高剂量组;E组:中剂量组;F组:低剂量组

注：A组:假手术组;B组:模型组;C组:洛汀新组;D组:高剂量组;E组:中剂量组;F组:低剂量组;与A组相比较,△△P<0.01,与B组比较,**P<0.01

4 讨论

慢性肾脏病及终末期肾病发病率呈现逐年上升的趋势,而肾间质损伤作为CKD发展至ESRD中间环节,而RIF是CKD进展至肾功能衰竭的共同病理过程[4],其发病机制主要与肾脏炎症损伤、氧化应激、细胞凋亡、细胞外基质过度沉积等相关。NF-κB属于核转录因子蛋白家族,作为炎症反应、氧化应激及免疫应答的关键启动因子[5]。在细胞受到刺激时,抑制NF-κB的因子IκB则出现蛋白酶解,引起NF-κB的活化。活化后它可促使肾纤维化相关细胞因子发生转分化,进而诱导肾脏组织发生纤维化[6],在肾间质损伤时NF-κB表达上调,亦可通过激活PI3K/AKT/NF-κB信号通路诱导肾间质炎症和肾间质纤维化的进程[7]。钙黏蛋白(E-cad)作为钙依赖性黏附分子,是细胞间连接的主要成份,它作为肾小管上皮细胞的标志性蛋白,对其结构和功能的完整性起到非常重要的作用,而肾小管上皮细胞间充质转分化又是形成RIF的主要病变途径,在肾间质发生病变时,组织中的E-cad表达下调,使其组织结构和功能遭到破坏[8],肾间质则可进一步发展至纤维化阶段。

在本研究中采用5/6肾切除大鼠建立肾间质损伤、纤维化模型。通过实验观察,在5/6肾切除模型组大鼠中可见肾小管上皮细胞扩张、变性萎缩甚至坏死,肾间质的纤维化等,此类病理改变与中医讲“虚”“瘀”理念不谋而合。研究显示五苓散[9]可促进E-cadherin和Smad7蛋白的表达而具有抗肾间质纤维化的作用。杨洪涛教授[10]认为肾络瘀阻是导致肾纤维化的主要病因,肾络损伤导致肾不能封藏,精微物质外泄,继而机体虚损,临床上表现为水肿、乏力、气血失调等一系列症状;沈金峰等[11]在前人研究的基础上,将肾纤维化微型癥积病机进一步发展为虚、湿、瘀、毒,本乃肾虚,标为湿、瘀、毒三邪为主;杨霓芝教授[12]则认为本虚标实贯穿于肾纤维化始终,主要病机乃虚、水湿、血瘀等。治疗上尤其强调脾肾两脏不离气虚、血瘀。综上所述,肾间质损伤病机不离虚和瘀,在治疗时以补虚泄实为原则。张沛虬[13]亦用补虚祛瘀的方法,并创补虚消癥汤治疗慢性肾病肾功能不全,获益良多。

祛风通络方是本研究小组通过二十余年肾病临床研究及实践,经过不断思考、完善、总结而成[14-18]。该方体现了标本兼治,通补兼施,内外同治的治疗原则,具有祛风通络、益气补肾之功效。方中乌梢蛇为君药,其功效可祛风通络,《本草逢源》言:“蛇性主风,而黑色属水,乌梢蛇主肾脏之风……性善无毒也。”现代药理研究[19]显示其水煎液和提取物具有抗炎作用;臣药为海风藤,功效祛风胜湿、通络,《本草再新》云:“行经络,和血脉,宽中理气,下湿除风……”现代药理研究[20]表明其具有抗氧化及免疫调节功能。黄芪为佐药,功效益气固表祛风,刘红等[21]通过研究发现,黄芪水煎液具有调节免疫、抗炎、降尿蛋白、降血脂以及延缓肾脏纤维化的作用。使药防风、生地、桑寄生,功效祛风养阴生津,现代药理研究中生地具有增强体液免疫及细胞免疫功能,桑寄生具有抗炎作用,防风具有抗炎、镇静镇痛、调节免疫等作用[22];唐雪栋等[23]在阿霉素肾病大鼠模型中发现地黄提取物可抗肾纤维化,对大鼠肾脏有一定的保护作用,现代药理研究亦证明其增强体液免疫及细胞免疫功能;孙响波等[24]研究表明黑地黄丸能明显改善肾纤维化大鼠肾组织微炎症状态,其作用机制可能与调节肾组织TLR2/NF-κB/Myd88通路有关;而桑寄生则具有抗炎作用。诸多研究证实该方通过各种信号通路的调控[25]在治疗 CKD 中延缓了其发展,抑制其走向肾间质纤维化。

本实验发现,与假手术组相比,模型组各大鼠血清肌酐、尿素氮及24 h尿蛋白定量均显著升高。在给予相应干预后血清肌酐、尿素氮及24 h尿蛋白定量均有不同程度好转,可以推测祛风通络方具有降低尿蛋白、改善肾脏功能,进而对肾间质损伤起到一定的延缓甚至改善作用。造模后大鼠肾脏组织中NF-κB mRNA和蛋白呈现高表达,干预结束后西药及祛风通络方不同剂量组NF-κB mRNA和蛋白明显下降,而高剂量组较显著;在E-cad mRNA和蛋白表达方面,与假手术组相比,5/6肾切除大鼠肾脏组织中呈现低表达,干预结束后西药及祛风通络方各剂量组表达明显上调,因此说明了祛风通络方可以通过对NF-κB的抑制及对E-cad的上调,减轻肾间质的损伤,进而延缓5/6肾切除大鼠肾间质纤维化的程度。祛风通络方通过下调NF-κB的表达、增加E-cad表达,对肾小管间质损伤及纤维化起到延缓甚至改善作用。但两者是否互为因果,还是独立发挥作用还有待我们在今后的研究中进一步探寻。