耿丽华 史越 宫国义 宋顺华

摘    要：针对以南瓜为嫁接砧木的一种西瓜、甜瓜枯萎病，采用形态学和分子生物学方法鉴定了病原菌，并开展该病原菌的致病性试验，为该病害的有效防控提供依据。结果表明，该枯萎病病原菌为瓜亡革菌Thanatephorus cucumeris （Frank） Donk。人工接种该病原菌后，供试的13个蔬菜种类（西瓜、南瓜、西葫芦、甜瓜、黄瓜、茄子、番茄、辣椒、萝卜、甘蓝、油菜、花椰菜和白菜）共计31个品种都能感病，品种的平均发病率为24.4%～100.0%。其中，供试的南瓜和西葫芦对病原菌最为敏感，供试品种发病率均为100%，辣椒较为抗病，供试的2个品种平均发病率为29.5%。研究确定了引起以南瓜为嫁接砧木的西瓜、甜瓜枯萎的病原菌为瓜亡革菌，参加试验的13个蔬菜种类普遍感病。不同种类蔬菜之间以及同一种蔬菜的不同品种之间存在抗感差异。

关键词：西瓜、甜瓜；枯萎病；病原菌；瓜亡革菌；致病性

中图分类号：S432.4+4     文献标识码：A 文章编号：1673-2871（2023）09-016-06

Identification of watermelon and melon wilt disease caused by Thanatephorus cucumeris and its pathogenicity to vegetables

GENG Lihua， SHI Yue， GONG Guoyi， SONG Shunhua

（Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Horticultural Crops of North China Area， Ministry of Agriculture and Rural Affairs/Key Laboratory of Urban Agriculture（North）， Ministry of Agriculture and Rural Affairs/Vegetable Research Institute， Beijing Academy of Agricultural and Forestry Sciences， Beijing 100097， China）

Abstract： The pathogen of wilt disease in watermelon and melon grafting pumpkin stocks was identified according to the morphological and molecular characteristics， and its pathogenicity to vegetables was tested ， aiming to control the disease effectively. The results showed that the pathogen is Thanatephorus cucumeris （Frank）Donk. by inoculating this pathogen on various vegetables， the pathogenic range test showed that a total of 31 vegetables varieties （13 species：watermelon， pumpkin， squash， melon， cucumber， eggplant， tomato， hot pepper， radish， cabbage， rape， cauliflower and Chinese cabbage） were susceptible  to the pathogen， incidence rate of varieties was between 24.4%-100.0%， among which pumpkin and zucchini plants were the most susceptible， the incidence rate of the tested varieties was 100.0%. Pepper plants were less susceptible to the pathogen， the average incidence rate of the 2 tested varieties was 29.5%. In conclusion， Thanatephorus cucumeris was identified as pathogen of watermelon and melon wilt grafting pumpkin stocks in this study. The 13 vegetable species in this experiment were generally susceptible. There were differences in disease resistance among different vegetable species and different varieties of the same vegetable.

Key words： Watermelon and Melon; Wilt disease; Pathogen; Thanatephorus cucumeris; Pathogenicity

西瓜、甜瓜是夏季的主要水果，我國是全球西瓜、甜瓜最大的生产和消费国，随着产业的规模化和设施化，西瓜、甜瓜种植的连作障碍问题日趋严重，土传病害是其中的主要问题之一。

由土壤习居菌引起的西瓜、甜瓜根部病害在世界范围内普遍发生，导致幼苗猝倒、根部腐烂和植株萎蔫。据报道，国内能引起西瓜、甜瓜幼苗根腐、成株枯萎的病原菌有10多个属[1]，常见的有腐霉菌（Pythium spp.）、疫霉菌（Phytophthora spp.）、枝顶孢菌（Acremonium cucurbitacearum）和尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）等[2-4]，国外也报道了很多病原真菌可导致瓜类根腐和枯萎病害，其优势致病菌为丝核菌（Rhizoctonia spp.）、镰刀菌（Fusarium spp.）、管释单孢囊菌（Monosporascus cannonballus）、枝顶孢菌（Acremonium cucurbitacearum）、烟草苷菌（Plectosporium tabacinum）及根盘菌（Rhizopycnis vagum）等[5-8]。除此之外，与西瓜、甜瓜根腐和萎蔫病害相关的病原菌还有马铃薯壳孢属菌（Pyrenochaeta lycopersici）、菜豆壳球孢菌（Macrophomina phaseolina）和大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）[5， 9]。

引起瓜类枯萎病的病原菌较多，其中以尖孢镰刀菌最为突出，曾在我国西瓜生产中的发生面积约占总栽培面积的42%[10]，是一种世界性的毁灭性土传病害，成为导致全球西瓜产量和品质降低的严重障碍之一[11]。嫁接栽培可有效地防治尖孢镰刀菌引起的瓜类枯萎病。日本早在20世纪80年代即选育出抗尖孢镰刀菌南瓜专化型F. oxysporum f. sp. lagenariae的南瓜品种Renshi，作为砧木并广泛应用[12]，我国在80年代末应用嫁接技术防治西瓜枯萎病，在生产中也得到了广泛应用，南瓜是最常用的砧木之一[10]。采用南瓜嫁接栽培是防控西瓜、甜瓜枯萎病十分有效的措施之一。

近几年来，笔者在工作中时常遇到西瓜、甜瓜种植者反映，采用南瓜砧木嫁接的西瓜、甜瓜发生枯萎病，并对南瓜砧木的抗病性产生疑问。发生该病的西瓜、甜瓜往往苗期生长正常，而在初果期或果实膨大期植株发生枯萎，虽然在生产上没有普遍发生，但是发生严重的棚室发病率可达100%，植株在果实尚未成熟之前发生枯萎，造成绝收。为了弄清楚病害发生的原因，笔者采集了典型的发病植株，进行病原分离和鉴定，以便为今后生产上预防和控制该病害提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

具有典型发病症状的西瓜和甜瓜植株于2019年5月采自大兴春茬西瓜、甜瓜种植大棚。

试验选用京研益农（北京）种业科技有限公司提供的13个蔬菜种类，共计31个品种进行致病性测定，品种名称见表1。

真菌基因组DNA快速抽提试剂盒，购买于北京新时代众合科技有限公司；其他无机试剂均为国产分析纯试剂。

马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：马铃薯200 g、琼脂17 g、葡萄糖20 g、蒸馏水1000 mL，于120 ℃高压灭菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分离纯化 从典型发病植株根茎的病健交接处切取小块组织，放到75%乙醇中浸泡2 s，使用灭菌水清洗3次，然后用灭菌滤纸吸干水分，置于PDA平板培养基上，在25 ℃恒温条件下暗培养，长出菌丝后，进行分离和纯化。

1.2.2 分离物致病性测定 分离物的培养：将分离物接种到PDA平板培养基上，在25 ℃条件下暗培养5 d，用打孔器从菌落边缘打取直径为7 mm的菌丝块供试验使用。

接种方法：试验在北京市农林科学院蔬菜研究所的抗病温室中进行。取直径为90 mm的小育苗盒，在最底层铺1/3育苗盒高度的灭菌培养基质，第2层放置5个病原菌菌丝块，第3层覆盖1/3育苗盒高度的灭菌培养基质，第4层播4粒西瓜（京颖）或甜瓜（京玉5号）种子，第5层覆盖1/3育苗盒高度的灭菌培养基质，以接种5个直径为7 mm的空白PDA培养基块作为对照（CK），每处理3个育苗盒。每天检查出苗及幼苗发病情况，直到播种后15 d。以地上部出现萎蔫、幼苗死亡、茎基部出现褐变开裂或根系变色为发病标准。

1.2.3 病原菌的鉴定 形态学鉴定：将病原菌接种在PDA培养基上，25 ℃恒温暗培养，观察菌落形态特征。根据相关资料进行菌种的鉴定[13]，确定病原物种类。

分子生物学鉴定：将病原菌接种在PDA培养基上，25 ℃恒温暗培养5 d，收集菌丝体，加液氮研磨成粉末，用真菌试剂盒提取其DNA；用真菌通用引物ITS1/ITS4进行该病原菌rDNA核糖体内转录间隔区的PCR扩增，扩增片段由北京新时代众合科技有限公司进行测序，将得到的序列在NCBI中检索，下载同源序列，使用MEGA7软件用邻接法构建系统发育树，用自举法对发育树进行1000次重复检验。

1.2.4 病原菌的致病范围测定 供试品种见表1。

病原菌的培养和接种方法同1.2.2。葫芦科和茄科蔬菜每育苗盒播种4粒种子，十字花科蔬菜每育苗盒播种6粒种子，每处理3个育苗盒，重复3次，随机区组设计。每天检查出苗及幼苗发病情况，观察至播种后15 d时，将未病死的幼苗小心拔出，冲洗干净，检查根部的发病情况，计算幼苗的发病率，幼苗的发病率/%=发病幼苗数量/幼苗总数量×100。所有供试品种的发病率取播种后15 d的平均观察值。

2 结果与分析

2.1 症状观察

甜瓜植株的发病症状为茎基部产生黄褐色水渍状凹陷斑，后期颜色变深（图1-A），有的扩展至环茎一周，呈蜂腰状缢缩（图1-B），拔出病株可见病原菌主要侵染根尖及根茎部的皮层（图1-C）；发病严重的全株枯萎（图1-D）。西瓜植株的发病症状与甜瓜类似。

2.2 分离物致病性测定

通过病原菌分离培养，从甜瓜根部与茎基部获得分离物JLFT1-150428-1，从西瓜根部与茎基部获得分离物JLFX-150428-2，对2个分离物分别进行致病性试验，均能使寄主发病，且症状与田间发病症状相同，对照处理的幼苗生长正常，没有出现任何发病症状（图2）。分别从接种发病的寄主上分离病原菌，获得的分离物分别与JLFT1-150428-1和JLFX-150428-2形态相同，表明JLFT1-150428-1和JLFX-150428-2均为病原菌。

2.3 病原菌鉴定

2.3.1 形态学特征 在25 ℃黑暗条件下培养，2个病原菌在PDA培养基上的菌落形态相同，初期无色至乳白色，呈放射状扩展（图3-A～B），随着培养时间的增加，菌落颜色逐渐变深至浅黄，老熟菌丝黄褐色，后期可形成菌核（图3-C）；显微镜观察结果表明，其菌丝分枝与主枝近于直角，且在分枝基部有明显缢缩，在分枝不远处有一个隔膜，与主枝分隔开（图3-D）。

2.3.2 分子生物学鉴定 分别提取2个病原菌菌株的DNA，对rDNA-ITS序列进行PCR扩增，获得大小分别为642和650 bp的2个片段。将这2个片段的序列分别提交至NCBI，进行同源序列检索，结果都与JF699278（Thanatephorus cucumeris）的序列同源性最高，均為100%。

基于2個病原菌菌株JLFT1-150428-1和JLFX-150428-2的rDNA-ITS序列与NCBI中的相关序列构建系统发育树（图4），这2个病原菌均与JF699278聚在一起，因此，这2个病原菌相同，为瓜亡革菌Thanatephorus cucumeris （Frank） Donk。

综合形态学特征和分子生物学鉴定结果，表明引起该病害的病原菌有性态为Thanatephorus cucumeris （Frank） Donk，属于担子菌亚门瓜亡革菌属瓜亡革菌；无性态为半知菌亚门丝核菌属立枯丝核菌（Rhizoctonia solani Kühn）。

2.4 病原菌致病性测定

病原菌致病性试验结果表明，该病原菌可侵染供试的13个种类共计31个蔬菜品种（表2）。人工接种后，供试的蔬菜品种全部感染病原菌，31个品种的平均发病率为24.4%～100.0%。其中，南瓜和西葫芦对病原菌最敏感，供试品种的发病率均为100.0%；辣椒较为抗病，供试的2个品种发病率分别为24.4%和34.5%；供试的3个黄瓜品种的发病率为44.4%～94.4%；供试的3个萝卜品种的发病率为33.4%～71.8%；供试的3个白菜品种的发病率为50.0%～97.1%。由此可见，同种作物的不同供试品种之间发病率不尽相同，甚至存在较大差异。

3 讨论与结论

通过病原菌的形态学特征观察，结合分子生物学鉴定，笔者的研究结果表明，近年来在南瓜砧木嫁接的西瓜、甜瓜上所发生的一种枯萎病，其病原菌为瓜亡革菌。瓜亡革菌侵染西瓜、甜瓜的根尖及根茎部的皮层，造成根腐，进而使植株萎蔫。目前已知有10余个病原菌能引起西瓜、甜瓜成株枯萎，最常见的是尖孢镰刀菌[10]。而笔者研究的南瓜砧木嫁接的西瓜、甜瓜上发生的枯萎病，并非由最常见的尖孢镰刀菌侵染引起。单凭田间症状难以准确识别病原菌的种类，而对不同种类病原菌所引起的病害，往往在防控方法上有着很大差异，因此，准确鉴定病原菌种类是有效控制病害的前提。

瓜亡革菌属于担子菌亚门瓜亡革菌属，其无性态为半知菌亚门丝核菌属立枯丝核菌。瓜亡革菌是一种非常复杂的土壤习居菌，根据菌丝的融合情况可划分为14个融合群[14]，大多数类群为植物病原真菌，多引起植物的茎部病害。该菌的寄主范围非常广泛，包括260多种植物，它可以侵染水稻、玉米、大豆、马铃薯等农作物和几乎所有的蔬菜作物，引起多种作物的立枯病[15-17]。瓜亡革菌引起水稻纹枯病，为水稻上的三大病害之一，严重影响了水稻的产量和质量[18]；侵染烟草叶片引起的烟草靶斑病，田间损失可达50%[19-21]。

立枯丝核菌导致的西瓜、甜瓜苗期病害，即西瓜、甜瓜立枯病在生产中比较常见，但是瓜亡革菌（立枯丝核菌）导致西瓜、甜瓜成株期病害的研究比较少见。笔者的试验结果表明，瓜亡革菌可侵染供试的所有蔬菜品种，但是对于不同种类的蔬菜作物致病力是有差异的，比如在同等的高接种压力下，辣椒的发病率明显低于其他作物，据此推测，采用辣椒与瓜类轮作会有助于减轻该病害的发生。

在供试的不同种类蔬菜作物中，不同品种对于该病原菌存在抗感差异，因此，针对该病害，有望筛选培育出抗病性较强的品种，来降低在生产上的危害程度，提高蔬菜产量和品质。

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