李秀萍, 简莹娜, 胡 勇, 王戈平, 郭文业, 马利青*

(1.青海大学畜牧兽医科学院,青海 西宁 810016;2.青海省门源种马场,青海 门源 810200)

志贺氏菌也称痢疾杆菌,属于革兰氏阴性短小杆菌,临床上可引起细菌性痢疾,肠道的炎症反应是志贺氏菌病的一个重要特征,主要表现为结肠的水肿、溃疡及炎症[1]。志贺氏菌包括4个种48个血清型,4个种分别为痢疾志贺氏菌(Shigelladysenteriae)、弗氏志贺氏菌(Shigellaflexneri)、宋内氏志贺氏菌(Shigellasonnei)和鲍迪氏志贺氏菌(Shigellaboydii),其中弗氏志贺氏菌和宋内氏志贺氏菌主要引起地方性流行性痢疾,鲍迪氏志贺氏菌主要引起重症菌痢(此病少见)[2]。弗氏志贺氏菌致病率最高[3],也是我国的主要流行菌株[4,5]。

边缘无浆体病(Anaplasmosis)是由边缘无浆体(Anaplasmamarginale)引起的,经节肢动物传播、寄生于反刍动物红细胞内的一种传染病,又称边虫病。该病以发热、贫血、黄疸、流产、衰弱和渐进性消瘦为特征,但急性发病时也可造成动物死亡[6]。系统进化分析法表明无浆体科分为4个属,即无浆体属、埃希氏体属、沃尔巴克氏体属、新立克次氏体属,4个属内部微生物相似性分别为96.1%、97.7%、95.6%和94.9%。无浆体属于立克次氏体目(Rickettsiales)无浆体科(Anaplasmataceae)无浆体属(Anaplasma)。无浆体属中的边缘无浆体(A.marginale)、中央无浆体(A.centrale)和绵羊无浆体(A.ovis)3个种能感染反刍动物[7]。中央无浆体因大多寄居于红细胞的中央而得名,因其低致病性而被用于制作活疫苗,但是偶尔也能造成临床疾病的发生。绵羊无浆体宿主较广,只能感染羊,不会引发牛的持续感染[8]。

1 材料与方法

1.1病料来源

青海省门源种马场饲养的一群成年牦牛于2022年7月份开始出现腹泻、精神状态差、逐渐消瘦等症状,严重者最后衰竭死亡,共发病100余头、死亡12头。当地兽医站工作人员前往发病地点采集了病牛的粪样及病死牛的内脏2份,送至青海大学畜牧兽医科学院兽医生物技术研究室进行检测。

1.2试验材料

营养肉汤、营养琼脂培养基购自海博生物科技有限公司;鲜血平板为营养琼脂培养基加入5%脱纤维绵羊血,为本实验室自制;实验用小白鼠购自青海央宗药业有限公司;分子试剂琼脂糖、Trans 2K DNA marker等购自北京全式金生物科技有限公司。

1.3试验方法

1.3.1细菌的分离培养 将采集送检病牛的粪样及病死牦牛的2份内脏(心、肝、脾、肺、肾及腹泻粪便)病料(标记为1#、2#)分别无菌接种至鲜血平板、普通肉汤和厌气肝汤等培养基中,在37℃培养箱中培养24 h,之后对培养物进行染色镜检。

1.3.2致病性试验 将分离纯化的可疑菌在37℃条件下培养18 h,经腹腔注射给2只实验小白鼠,小白鼠约18 g/只左右,2只实验小白鼠注射培养物分别为0.2 mL/只、0.5 mL/只,对照组小白鼠一只,腹腔注射营养肉汤培养基0.5 mL。

1.3.3分子生物学检测 对病料组织(1#脾脏、2#脾脏)进行组织DNA提取,对纯化后的分离菌进行细菌基因组DNA提取,对提取的组织以及细菌基因组DNA进行16S rRNA PCR扩增,将扩增产物进行切胶,然后送至金唯智生物科技有限公司进行测序鉴定。

1.3.4药物敏感性试验 对分离纯化且具有致病性的菌株用K-B扩散法进行药敏试验。按照美国临床实验室标准化研究所(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)的标准判定为敏感(S)、中敏(I)或耐药(R)[9]。

2 结果

2.1细菌分离培养结果

腹泻粪便在血平板培养基中生长出β溶血菌落,菌落形态圆形凸起、光滑透明状,经染色镜检发现其形态为革兰氏阴性杆菌,详见图1。1#脾脏在血平板培养基中生长出β溶血大菌落,经染色镜检发现其形态同为革兰氏阴性杆菌(与粪便分离菌的形态一致),未分离到其他疑似致病细菌。

2.2致病性试验结果

将该β溶血菌落接种至营养肉汤培养基中进行纯培养,37℃培养18 h,将纯化后的菌液给小白鼠进行腹腔注射,结果2只小白鼠均于注射后24 h内死亡,说明该菌有致病性。剖解小鼠发现其肝脏损伤,出现胃肠鼓气、腹泻。将肝脏涂片、瑞特氏染色可见短杆菌,与分离细菌形态一致。将解剖小鼠的肝脏无菌接种至鲜血平板,24 h后血平板中的细菌菌落形态与之前分离细菌一致。

2.3分子生物学检测结果

将1#、2#脾脏组织以及分离菌株经细菌16S rRNA PCR扩增,详见图2。经测序比对证实分离菌株为弗氏志贺氏菌,也被称为痢疾杆菌;1#脾脏组织16S rRNA检测到边缘无浆体中央亚种,2#脾脏未获得完整测序结果。

2.4分离菌株药敏试验

分离菌株对多数药物呈现不同程度的耐药,仅对氧氟沙星和左氧氟沙星敏感,详见表1。依据试验结果,指导该马场专业技术人员将氧氟沙星作为首选药物进行治疗,均治愈。

表1 分离菌株(弗氏志贺氏菌)的药敏试验结果

3 结论与讨论

3.1经病原菌的分离培养、致病性试验、PCR及测序分子鉴定,结合其临床症状,确诊本次门源马场牦牛死亡是由于弗氏志贺氏菌与边缘无浆体中央亚种合并感染所致。本试验通过16S rRNA基因扩增并测序分析发现,分离菌为弗氏志贺氏菌,脾脏组织中检测出边缘无浆体中央亚种。

3.2在本次致病性试验中,将分离菌小白鼠腹腔注射后,小白鼠死亡率为100%。对志贺氏菌病主要使用抗菌素进行治疗,但随着抗生素的滥用和过度依赖,志贺氏菌的耐药问题日益严重[10]。药敏试验结果显示,本次分离菌对阿莫西林、克林霉素、利福平、多粘菌素E、氨苄青霉素、红霉素、呋喃妥因、庆大霉素、氨苄西林、先锋霉素及头孢吡肟11种药物耐药,对氧氟沙星敏感。将药敏试验结果及时反馈给马场,技术人员使用氧氟沙星对病畜给予治疗后,该场的病情得到了缓解和控制,说明选择敏感药物治疗可降低死亡率。牛边缘无浆体病是由边缘无浆体感染牛引起的一种蜱传性疾病,加强牛只管理、定期进行驱虫是预防该病的优选方法。

3.3志贺氏菌作为一种高度接触性传染病,自19世纪末起开始被人们认识和了解[11]。该病发病率高、分布广泛,临床表现是水样腹泻、发热和腹部疼痛,继而转为典型痢疾。近年来的报道表明,志贺氏菌除了感染人以外,也给养殖生产和动物源性食品安全带来严重的威胁和挑战[12,13]。因此,应加强志贺氏菌等人兽共患细菌传染病的检验监测和预测预报,有效保障动物源性食品卫生安全。

3.4引起牛肠道腹泻的常见病原还包括大肠杆菌、副结核病、沙门氏菌、病毒性腹泻和黏膜病毒等[14]。志贺氏菌病与上述疫病的临床鉴别诊断有如下要点:牛大肠杆菌病以1～2周龄的犊牛最易感染发病,一般体温不高,排灰白色粥样粪便;牛副结核病表现间歇性顽固性腹泻,下颌肿胀,潜伏期长,4～6月龄多发;牛沙门氏菌病以出生后30～40 d犊牛最为易感,粪便黄色、恶臭,关节肿胀;病毒性腹泻和黏膜病无论新生犊牛和成年牛均可感染发病,而且不分季节,排水样或血样粪便,有时伴有肺炎。本次检测及药敏试验结果为今后诊治牦牛肠道腹泻病提供了参考。