牛 璐, 孟宪梅,邵 国

(1.包头医学院,内蒙古 包头 014040;2.包头医学院第二附属医院消化内科)

胃食管反流病(gastroesophageal reflux disease,GERD)是临床常见的消化系统疾病,其中反流性食管炎(reflux esophagitis,RE)是胃食管反流病的一种主要亚型,伴有食管鳞状上皮不同程度的损伤,一般通过内镜结合临床信息进行诊断。目前的治疗主要依靠质子泵抑制剂。然而,患者服用质子泵抑制剂往往会经历频繁的复发和反流烧心症状的困扰。因此加深对反流性食管炎发病机制的理解对于开发新的治疗反流性食管炎的策略非常重要。

反流性食管炎的发生发展存在多种机制参与,主要包括食管清除能力降低相关的反流发生机制、内脏敏感性相关的症状形成机制以及食管黏膜损伤机制等。近些年来关于黏膜损伤发病机制方面仍存在争议。传统认为,反流性食管炎是由胃肠反流物造成的直接腐蚀性损伤。2009年,Souza等[1]建立了食管十二指肠造瘘术诱导的反流性食管炎大鼠模型,在实验中发现鳞状上皮细胞暴露于酸化胆汁盐显著增加了白细胞介素-8(interleukin-8, IL-8)和白细胞介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)的分泌,酸受损的上皮细胞周围出现非特异性炎症浸润,基底细胞和乳突状增生先于表面糜烂的发生,这些发现与传统认为的腐蚀性化学损伤的预期结果相矛盾。作者提出食管上皮损伤是炎症免疫细胞反应的结果,而不是其前因。之后也有许多数据支持这一观点[2-6],为细胞因子介导的炎性细胞浸润是反流性食管炎发病机制中初始事件的概念提供了进一步支持。

长链非编码RNA HOTAIR(HOX transcript anti-sense intergenic RNA)作为研究比较清楚地参与人HOX基因簇调控的lncRNA[7],是参与免疫和炎症通路的重要分子[8-11],且有研究表明HOTAIR在食管疾病中扮演重要角色[12]。值得注意的是,在人体液中存在的lncRNA[13-15]可为无创诊断提供便利,因此研究HOTAIR在反流性食管炎中的表达变化可能会为反流性食管炎的无创诊断和特异性治疗提供潜在的新靶点。

本研究利用反流性食管炎糜烂处黏膜组织和内镜下观察正常黏膜组织进行转录组测序,探索两种组织间差异表达的基因,并通过生物信息学对差异表达基因进行分析,从免疫反应相关的基因中筛选出HOTAIR后,对其表达变化与RE的临床特征加以分析,以期为反流性食管炎的黏膜损伤机制提供新的理论依据和诊断靶点。

1 材料与方法

1.1实验样本 实验样本来自2020年10月至2021年10月于我院消化内科内镜下诊断反流性食管炎LA分级≥B级食管炎患者,于反流性食管炎患者食管黏膜糜烂取材作为研究组(RE,R组);应用自体对照原则,取同一食管炎患者糜烂旁组织(距离食管糜烂组织5 cm以上,且内镜下黏膜正常处)作为对照组(Normal,N组)。患者14例,男性10例,女性4例;年龄42～79岁,年龄中位数为62.5;洛杉矶分级B级11例,C级2例,D级1例。排除标准: 合并严重肝肾功能异常者;患有肿瘤者。本实验经包头医学院第二附属医院医学伦理委员会批准,所有患者在行内镜检查前签署知情同意书。

1.2主要试剂 Trizol(美国Invitrogen公司)、DEPC原液(美国Sigma-Aldrich公司)、反转录试剂盒(Thermo Fisher Scientific公司)、引物(上海生工公司)、SYBR Green PCR Master Mix(北京康为世纪公司)。

1.3方法

1.3.1转录组测序和生物信息学分析 反流性食管炎糜烂处组织和糜烂旁组织: R组、N组两组样本送上海美吉生物医药科技有限公司进行测序,差异表达结果在美吉生物云平台(cloud.majorbio.com)采用生物信息学方法进行通路富集分析并分析差异表达基因。

1.3.2实时荧光定量PCR 检测HOTAIR mRNA水平 从-80 ℃冰箱取反流性食管炎R组和N组组织,Trizol法提取总RNA,将其反转录成cDNA,使用ABI7900实时荧光定量PCR仪和SYBR染料法检测R组和N组HOTAIR的表达情况,采用β-actin为内参。引物序列如下:(1)HOTAIR:上游引物为5′-CAGTGGGGAACTCTGACTCG-3′,5′-下游引物为GTGCCTGGTGCTGTCTTACC-3′;(2)β-actin:上游引物为5′- CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′;下游引物为5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT -3′。引物由上海生工合成。取1 μg 总RNA 进行反转录,添加1 μL Oligo dT和1 μL Random primers,20 μl 体系反应。将反转录得到的cDNA用于后续qRT-PCR反应。

2 结果

2.1反流性食管炎的转录组测序和生物信息学分析 反流性食管炎糜烂组(R组)样本和糜烂旁组(N组)两种组织间有多种基因差异表达,与N组相比,R组有1 290个基因表达上调,7 661个基因表达下调,反流性食管炎糜烂组总体表现为基因表达下调。通过KEGG生物信息学分析显示主要差异基因涉及炎症引起的免疫反应(图1)。

图1 反流性食管炎(RE)样本和正常黏膜组织进行表达谱二代测序生物信息学分析

2.2反流性食管炎中HOTAIR的表达变化 实时荧光定量PCR结果显示,与糜烂旁组(N组)相比,反流性食管炎糜烂组(R组)的HOTAIR mRNA表达下降,但差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3HOTAIR mRNA表达与反流性食管炎患者临床参数的关系 虽然HOTAIR可能在反流性食管炎所有群体中变化不显著,但仍可能与反流性食管炎具体临床特征密切相关。于是本研究分析了HOTAIR表达与反流性食管炎患者年龄、性别和LA分级的关系。结果显示两组HOTAIR mRNA的相对表达量差值与患者年龄相关(r2=0.7442,P<0.05),但与性别、LA分级无关(P>0.05)。见图2。

图2 配对样本HOTAIR mRNA差值与年龄相关性

2.4HOTAIR mRNA表达与反流性食管炎患者年龄分布的关系 鉴于HOTAIR mRNA的相对表达量差值与患者年龄相关,研究又以年龄中位数分组进行HOTAIR表达变化的详细检测。患者年龄中位数为62.5,年龄 ≥62.5的有7例为大年龄组,年龄 <62.5的有7例为小年龄组。在大年龄组中反流性食管炎R组中HOTAIR mRNA表达高于N组(P<0.05)(图3)。在小年龄组中反流性食管炎R组中HOTAIR mRNA表达低于N组(P<0.05)(图4)。结果显示HOTAIR表达变化在不同年龄患者中呈现相反的趋势,提示HOTAIR可能作为不同年龄反流性食管患者的潜在诊断标志物。

图3 大年龄组中反流性食管炎组织(R组)和炎症旁组(N组)中HOTAIR mRNA表达n=7,**P<0.05

图4 小年龄组中反流性食管炎组织(R组)和炎症旁组(N组)中HOTAIR mRNA表达n=7, *P<0.05

3 讨论

反流性食管炎(reflux esophagitis,RE)是胃食管反流病的一种主要亚型,亚洲的发病率约为5 %[16],我国成年人症状性GERD的患病率已达3.1 %,其中大部分为反流性食管炎[17]。目前关于胃食管反流的发病机制是酸性消化性化学损伤还是免疫细胞的炎症因子引起的黏膜损伤有一定的争议。2009 年一项利用大鼠研究显示,对鳞状黏膜的实际损伤可能不是由于酸/胆汁反流直接引起的,而是从淋巴细胞的黏膜下浸润开始,随后淋巴细胞向上进展到上皮表面。研究表明胃食管反流物不直接损伤食管上皮细胞,但刺激其分泌吸引免疫细胞的炎症因子,最终损伤黏膜[1]。截至目前,Souza等[4]发表的这篇关于胃食管反流病病因的文章被引用多次,众多研究学者对这个观点进行了实验验证。同时,有临床研究表明,停止 PPI 药物治疗与 T 淋巴细胞为主的食管炎症以及基底细胞和乳突状增生有关,但表面细胞没有丢失。该发现表明反流性食管炎的发病机制可能是细胞因子介导,而不是化学损伤的结果[4]。因此反流性食管炎的发病本质很可能是由胃酸等刺激引起的免疫反应。明确反流性食管炎的发病机制是可能找出某些患者PPI药物治疗效果欠佳的原因的一条有效途径,可能成为优化胃食管反流治疗方案的一个突破点。利用二代测序技术可以得到反流性食管炎糜烂处和内镜下食管黏膜正常处两种组织间差异表达的基因,而二代测序技术结合生物信息学可作为反流性食管炎黏膜屏障损伤机制相关基因有前景的筛选技术。本研究主要通过生物信息学探讨了反流性食管炎糜烂组(R组)和糜烂旁组(N 组)两种组织间基因表达的差异及与反流性食管炎黏膜损伤机制的联系。反流性食管炎具有反复发作、慢性迁延、治疗药物单一和部分患者抑酸治疗效果欠佳等特点。除机械屏障功能不全之外,明确食管黏膜屏障损伤的发病机制及分子机理是解决该临床问题的一个重要前提。

lncRNA 可以通过转录和转录后等多种表观遗传方式进行基因表达调控,它们的失调是导致的某些人类疾病的分子基础,成为当前的研究热点。许多lncRNA在胃肠道疾病发生中有重要作用[18-19]。本研究发现lncRNA HOTAIR在糜烂组与非糜烂组的表达差异,提示HOTAIR在反流性食管炎黏膜糜烂相关机制中起重要作用,但作用尚不明确。

年龄是与反流性食管炎相关的一个独立因素[22]。老年群体的研究和新型生物标志物的探寻在反流性食管炎的防治中至关重要。反流性食管炎患者中,老年组患者多于中青年组患者;老年组患者伴反酸症状的比例低于中青年组,老年组患者病变程度较重,发病后,给予药物保守治疗,老年及中青年均可取得良好的治疗效果,但中青年疾病复发率更低[21]。本研究同样佐证了反流性食管炎中老年人群可能与中青年人群存在着不同的发病机制。而有关衰老发生的机制并不是非常明确,研究证实以炎症因子水平增高为特点的炎症状态与衰弱的病理生理机制密切相关,这种炎症状态直接或间接地对老年人的各组织各系统产生危害。反流性食管炎黏膜组织间的差异是如何影响众多基因表达改变和其中机制尚不明确。

本研究仍存在一定局限性。由于将患者的选择严格限定在反流性食管炎洛杉矶分级B、C、D级,且排除其他疾病,囊括的组织样本较少,结果代表性较弱。此外,以内镜下肉眼观察为分组标准,可能在糜烂旁组中存在一部分组织已产生反流性食管炎的组织学改变。应加入病理组织分析,进行苏木素-伊红染色和免疫组化实验,更好地区分糜烂与糜烂旁组的差异。本研究已经对反流性食管炎糜烂组织与糜烂旁组的基因差异表达形成了初步认识,并且发现HOTAIR在不同年龄组反流性食管炎患者配对组织中存在差异表达,提示HOTAIR表达可能参与衰老的过程。随着高通量测序技术和生物信息学的发展,为研究新的基因调控方式提供了更多的平台。未来对长链非编码RNA的进一步研究应该会对加深反流性食管炎的理解产生重要作用,长链非编码RNA功能的多样性将加深我们对反流性食管炎发病机制的认知。更重要的是,由于长链非编码RNA的特殊性易于检测并稳定,对长链非编码RNA的深入研究将为反流性食管炎早期诊断和无创诊断提供新的可能。