李 琰，刘佑晖，蔡虎志，林湘东，陈新宇*

湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007

肾纤维化（renal fibrosis, RF）临床特征表现为细胞外基质(extracellular matrik, ECM)大量累积与纤维细胞发生异常增生，从而引起肾间质纤维化与肾小球硬化[1-2]。 肾纤维化是各种慢性肾脏病进展到慢性肾衰竭的必经阶段[3]，也是慢性肾衰竭进展的病理基础[4]。 近年来，以肾纤维化为临床病理特征的慢性肾脏病，呈现出高发病率、高死亡率及逐年上升特点，已然成为危害人类健康的重大慢性疾病之一[5-6]。因此，有效抑制或逆转肾纤维化，对防治肾脏疾病的发生与延缓其病态的发展具有重要意义。 然而，至今还未发现抑制或治疗肾纤维化的有效方法[7-8]。

长链非编码RNA(long noncoding RNA, LncRNA)是一类长链非编码RNA，在肾纤维化中表达失调[9-10]。微小核糖核酸(microRNA, miRNA)是内源性非编码RNA，参与慢性肾脏疾病的发生和发展[11]。已有研究证实lncRNA/miRNA 参与肾纤维化的疾病过程[12-13]。据报道，lncRNA 可以调节糖尿病，并影响肾纤维化进展[14]。 比如，lncRNA OIP5-AS1 可以诱导上皮间质转化和肾纤维化[15]。沉默lncRNA TCONS_00088786可以减少肾纤维化[16]。lncRNA Blnc1 可以通过Nrf2/HO-1 和NF-κB 通路影响肾纤维化[17]。已有很多文献报道，miR-29c 家族在肾纤维化过程中扮演者重要角色[18-20]，其中miR-29c-3p 可以抑制纤维化，已然成了新热点[7]。 前期实验通过挖掘多个lncRNA，从中选择lncRNA LOC103694972，且通过生物信息学预测分析发现lncRNA LOC103694972 与miR-29c-3p 具有潜在的结合位点，但二者在肾纤维化及其治疗中的作用尚未可知。

温阳振衰颗粒，由附子、干姜、甘草、红参等组成，附子与干姜可以温肾养阳，甘草调虚补气，红参补火助阳[21-22]。 研究表明，温阳振衰颗粒可以通过l ncRNA MiR143HG/miR-143 治疗慢性心力衰竭[22-24]。临床上，温阳振衰颗粒常被用于治疗阳虚证慢性肾衰竭[25]，但目前关于温阳振衰颗粒在肾纤维化中的作用机制研究暂无报道。因此，温阳振衰颗粒是否通过调节lncRNA LOC103694972/miR-29c-3p 影响NRK-49F 细胞的纤维化有待探讨。本研究旨在探究温阳振衰颗粒对转化生长因子β1（transforming growth factor-β 1, TGF-β1）诱导的大鼠肾细胞（NRK-49F 细胞）纤维化的作用及其潜在机制，以期为肾纤维化的治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂

NRK-49F 细胞（货号iCell-r035）购自上海赛百慷生物技术公司。 温阳振衰颗粒（规格：8 g/袋，批号20210322）由湖南中医药大学第一附属医院药剂科提供。 缬沙坦胶囊（国药准字H20030153）购自北京诺华制药有限公司。 TGFβ1（货号ab50036）购自英国Abcam 公司。293A 细胞（货号HG-NC071），LOC103694972过表达或沉默质粒（货号HG-L23651）购自长沙Honorgene 公司。 Collagen Ⅰ抗体（货号14695-1-AP，1:2000），α-SMA 抗体（货号14395-1-AP，1∶6 000），βactin （货 号66009-1-Ig，1∶5 000），HRP goat anti-Rabbit IgG（货号SA00001-2，1∶6 000）购自美国Pro teintech 公司。

胎牛血清（货号10099141）和DMEM 高糖培养基（货号11995065）购自美国Gibco 公司。 ECL 超敏化学发光显色液试剂盒（货号AWB0005a）和BCA蛋白定量试剂盒（货号AWB0104c）购自长沙艾碧维生物有限公司。 双萤光素酶检测试剂盒（货号E1910）购自美国Promega 公司。

1.2 主要仪器

直热式二氧化碳培养箱（上海三腾仪器有限公司，DH-160I），超净工作台（北京亚泰科隆仪器技术有限公司，YT-CJ-2NB），倒置生物显微镜（北京中显恒业仪器仪表有限公司，DSZ2000X），多功能酶标分析仪（深圳市汇松科技发展有限公司，MB-530），荧光定量RCP 仪（赛默飞世尔科技公司，QuantStudio1），电泳仪（北京六一仪器厂，DYY-2C），化学发光检测仪（美国promega 公司，GloMax 20/20）。

1.3 大鼠含药血清的制备

本研究已获得湖南中医药大学第一附属医院实验动物伦理委员会的批准（ZYFY20220722）。斯泼累格·多雷（Sprague Dawley）大鼠购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司。 大鼠分别给予温阳振衰颗粒溶液（144 mg·mL-1），缬沙坦溶液（1 mg·mL-1）和生理盐水（10 mL·kg-1）灌胃处理，连续7 日，每日1 次。7 d 后，采用7%水合氯醛（5 mL·kg-1）麻醉大鼠，行腹主动脉取血。血液样本在2 500 r/min 离心10 min，取上清进行灭活（56 ℃，30 min）处理。采用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，获得各处理组血清。血清置-20 ℃冰箱保存备用。

1.4 细胞实验与分组处理

NRK-49F 细胞培养在DMEM 高糖培养基+15%胎牛血清，培养环境为37 ℃，5%CO2，饱和湿度。 当细胞密度达到80%～90%进行传代培养。 细胞随机分为正常组、TGF-β1 处理组（TGF-β1 组）、TGFβ1+10%空白组血清组（TGF-β1+B 组）、TGFβ1+10%温阳振衰含药血清组（TGF-β1+W 组）、TGF-β1+10%缬沙坦含药血清组（TGF-β1+X组）、TGF-β1+10%温阳振衰含药血清+si-NC 组（TGFβ1+W+si-NC 组）、TGF-β1+10%温阳振衰含药血清+si-LOC 组（TGF-β1+W+si-LOC 组）、TGF-β1+10%温阳振衰含药血清+oe-NC 组（TGF-β1+W+oe-NC 组）、TGFβ1+10%温阳振衰含药血清+oe-LOC 组（TGF-β1+W+oe-LOC）。 细胞在TGF-β1 组采用10 ng·mL-1TGF-β1 处理24 h。细胞在TGF-β1+B 组，TGF-β1+W 组和TGF-β1+X 组采用TGF-β1 与药物同时处理。 细胞在TGF-β1+W+si-NC 组，TGF-β1+W+si-LOC组，TGF-β1+W+oe-NC 组和TGF-β1+W+oe-LOC 组分别通过lip2000 转染2.5 μg 的si-NC，si-LOC，oe-NC和oe-LOC质粒48 h，然后进行TGF-β1 和药物干预。

1.5 CCK-8 实验

采用CCK-8 试剂盒检测温阳振衰血清对TGFβ1 处理后细胞增殖的影响。 取对数生长期的细胞，用胰酶消化细胞。 细胞离心后用完全培养基重悬，以5×103个细胞/孔的密度种植于96 孔板。培养24 h后，去除旧的培养基，按照实验分组分别加入TGFβ1 和含药血清，作用24 h。 然后，去除原培养基，每孔加入新鲜完全培养基90 μL，同时加入10 μL CCK-8 溶液，混匀。细胞在37 ℃、5% CO2培养箱中继续孵育4 h。采用酶标仪测定在450 nm 处的吸光度，实验结果以光密度值表征细胞活性大小。

1.6 实时荧光定量PCR

细胞消化、收集，加入RNA 保存液。 按照RNA提取试剂盒说明书提取总RNA。 使用逆转录试剂盒，将RNA 逆转录成cDNA。 再用实时荧光定量PCR 法测定lncRNALOC103694972，miR-29c-3p 的表达。 分别以β-actin 及5S 为内参对照基因。 引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。 引物序列为：miR-29c-3p，上游引物5'-GGCTGACCGATTTCTCCTGG-3'，下游引物5'-TCCCCCTACATCATAACCGATTT-3'，76 bp。 LOC103694972，上游引物5'-AAACGCCGAGATAGACCGAAC-3'，下游引物5'-GTCGTCCTACCGCCTTCGCTCA-3'，138 bp。β-actin，上游引物5'-ACATCCGTAAAGACCTCTATGCC-3'，下游引物5'-TACTCCTGCTTGCTGATCCAC-3'，223 bp。 5 s，上游引物5'-GCCTACAGCCATACCACCCGGAA-3’，下游引物5'-CCTACAGCACCCGGTATCCCA-3’，116 bp。PCR 反应参数为：30 μL 体系，预变性95 ℃10 min，变性95 ℃15 s，退火延伸60 ℃30 s，设置40 循环数。 数据分析以β-actin 作为内参，采用参照基因2-△△Ct法计算目的基因LOC103694972 和miR-29c-3p 的相对表达量。

1.7 双荧光素酶实验与分组

采用TargetScan 数据库（http://www.Targetscan.org/）预测LOC103694972 与miR-29c-3p 的结合位点，分别构建LOC103694972 野生型（psiCHECK-2-LOC972-WT）和突变型（psiCHECK-2-LOC972-Mut）质粒。将293A 细胞培养于DMEM 培养基中。待细胞密度达到80%～90%，用0.25%胰酶消化传代。取对数生长期细胞进行干预，随机分为：psiCHECK-2-LOC972-WT+NC mimics 组、psiCHECK-2-LOC972-WT+miR-29c-3p mimics 组、psiCHECK-2-LOC972-Mut+NC mimics 组、psiCHECK-2-LOC972-Mut+miR-29c-3p mimics 组。 细胞共转染和培养48 h后，收集细胞沉淀。 采用双荧光素酶活性检测试剂盒，根据说明书检测细胞荧光素酶活性，并计算海肾荧光素酶与萤火虫荧光素酶的比值。

1.8 Western blot

细胞按照分组给予相应处理后，收集细胞沉淀。各组加入适当的细胞裂解液裂解细胞，12 000 r/min，离心10 min，提取细胞总蛋白。 采用BCA 蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度。蛋白样品经过电泳分离（恒压80 V，约0.5 h；110 V，约1.5 h）后，通过转膜电泳（恒流300 mA，α-SMA约60 min，CollagenⅠ约120 min）转移到NC 膜。 膜加入一抗孵育，4 ℃过夜。 次日，TBST 洗膜3 次，每次15 min。 然后，膜加入二抗室温孵育2 h。 采用TBST 洗3 次，每次15 min。 将NC膜置于凝胶成像仪器中，滴加适量ECL 工作液。 通过凝胶成像仪采集图像，显影曝光。β-actin 为内参，使用Image J 软件进行条带分析。

1.9 统计学处理

采用SPSS 22.0 软件进行分析，符合正态分布的以“±s”数据表示。两组之间比较采用非配对T 检验。三组以上比较采用one-way ANOVA，Tukey's 进行事后检验。 P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 温阳振衰颗粒含药血清影响NRK-49F 细胞增殖

与正常组对比，模型组细胞呈现出长梭形，与周围细胞分离，出现纤维化，说明大鼠NRK-49F 细胞纤维化模型构建成功（图1A）。 经过TGF-β1+W 或TGF-β1+X 处理，NRK-49F 细胞呈扁圆形，纤维化减弱，趋向正常组（P＜0.05）（图1A）。CCK-8 实验结果显示，与正常组对比，TGF-β1 组吸光度升高（P＜0.05），表明细胞活力增加（图1B）。 与TGF-β1 组对比，TGF-β1+W 及TGF-β1+X 组吸光度显著降低，（P＜0.05）（图1B）。

图1 温阳振衰颗粒含药血清对TGF-β1 诱导NRK-49F细胞增殖的影响

2.2 温阳振衰含药血清影响NRK-49F 细胞中LOC103694972 和miR-29c-3p 的表达

与正常组相比，TGF-β1 处理组中LOC103694972表达水平明显升高（P＜0.01），miR-29c-3p 表达显著降低（P＜0.01）（图2A）。 与TGF-β1+B 组相比，TGFβ1+W 组中LOC103694972 表达水平降低（P＜0.01），miR-29c-3p 表达水平升高（P＜0.01）（图2A）。 TGFβ1+W 组干预效果与TGF-β1+X 组干预效果相近（图2A）。 且通过相关性分析，发现LOC103694972表达水平与miR-29c-3p 表达水平呈负相关（P＜0.001）（图2B）。

图2 温阳振衰颗粒含药血清对TGF-β1 诱导NRK-49F细胞中LOC103694972 和miR-29c-3p 表达的影响

2.3 LOC103694972 靶向调控miR-29c-3p

采用TargetScan 数据库预测miR-29c-3p 与LOC103694972 基因的结合位点（图3A）。荧光素酶实验结果进一步显示，与psiCHECK-2-LOC972-WT+NC mimics 组相比，psiCHECK-2-LOC972-WT+miR-29c-3p mimics 组293A 细胞中萤光素酶活性明显降低（P＜0.05）（图3B）。 与psiCHECK-2-LOC972-Mut+NC mimics 组 相 比，psiCHECK-2-LOC972-Mut+miR-29c-3p mimics 组293A 细胞中荧光素酶活性无明显变化（图3B）。

图3 双荧光素酶实验证实LOC103694972 靶向调控miR-29c-3p

2.4 过表达LOC103694972 阻断温阳振衰颗粒含药血清对TGF-β1 诱导NRK-49F细胞增殖、纤维化的作用

与TGF-β1+W 组相比，TGF-β1+W+oe-LOC 组中LOC103694972 表 达 水 平 升 高（P＜0.01），miR-29c-3p 表达水平降低（P＜0.01）（图4A）。 细胞形态学观察与CCK-8 检测结果oe-LOC 促进TGF-β1+W 组细胞的活力（图4B—C）。 此外，与TGF-β1+W组相比，TGF-β1+W+oe-LOC 组中α-SMA 蛋 白、Collagen Ⅰ蛋白表达水平升高（P＜0.05）（图4D—E）。

图4 过表达LOC103694972 抑制了温阳振衰颗粒含药血清对TGF-β1 诱导NRK-49F细胞的干预效果

2.5 沉默LOC103694972 促进温阳振衰颗粒含药血清对TGF-β1 诱导NRK-49F 细胞增殖、纤维化的干预效果

与TGF-β1+W 组相比，TGF-β1+W+si-LOC 组中LOC103694972 表达水平降低（P＜0.01），miR-29c-3p 表达水平升高（P＜0.01）（图5A）。细胞形态学观察与CCK-8 检测结果证明si-LOC 抑制TGFβ1+W 组细胞的活力（图5B—C）。此外，与TGF-β1+W 组相比，TGF-β1+W+si-LOC 组中α-SMA 蛋白、Collagen Ⅰ蛋白表达水平降低（P＜0.05）（图5D—E）。

图5 沉默LOC103694972 促进了温阳振衰颗粒含药血清对TGF-β1 诱导NRK-49F细胞的干预效果

3 讨论

近年来研究表明，中药多靶点、多途径治疗特点在抑制肾脏疾病的进展、恢复患者肾功能等方面有着很多优势[26-27]。 因此，寻找治疗肾间质纤维化的中医药，并探讨其作用的具体机制，可能有助于慢性肾衰竭的临床防治。 温阳振衰颗粒，由附子、干姜、甘草、红参等组成，可以治疗慢性心力衰竭[23，28-29]。TGF-β 通过上调基质蛋白合成、抑制基质降解、改变细胞-细胞相互作用导致组织纤维化[30]。 在3D 疾病模型中，TGF-β1 处理后，单层培养的HK-2 细胞中纤维化标志物α-SMA 蛋白的表达增加[31]。 NRK-49F 细胞常用于研究肾纤维化[32]。 本研究通过TGFβ1 干预NRK-49F 细胞诱导纤维化模型[33]，经处理24 h 后，细胞梭形变长，发生纤维化，说明细胞纤维化模型构建成功。 随后，本研究使用10%温阳振衰颗粒含药血清处理细胞后，发现细胞增殖受到抑制，呈扁圆形，趋向正常。这一结果与刘佑晖[25]等人的研究结果类似，证明温阳振衰颗粒对肾纤维化有治疗作用。

肾纤维化是众多慢性肾脏病的主要病理学基础,其发展过程跟很多因素有关，深入探究其病理机制可以为其治疗提供新的思路[34]。 肾纤维化中许多miRNA 和lncRNA 起重要作用，例如miRNA-184 靶向HIF1AN 来驱动肾纤维化[35]。 XU 等[22]人发现，温阳振衰颗粒可通过调控lncRNA MiR143HG/miR-143，促进ERK5 蛋白的表达和磷酸化，从而改善慢性心力衰竭。此外，lncRNA OIP5-AS1 诱导上皮间质转化和肾纤维化[15]。 LIANG 等[36]人的研究发现，miR-29c-3p 可通过靶向转化生长因子-2 和基质金属肽酶2，抑制心肌成纤维细胞中COL1A1、COL3A1和α-SMA 的表达。 本研究发现LOC103694972 与miR-29c-3p 之间存在靶向调控作用。 与此同时，经温阳振衰颗粒含药血清处理后，miR-29c-3p表达水平升高，且LOC103694972，α-SMA、Collagen Ⅰ表达水平降低。这些均证实温阳振衰颗粒含药血清可能通过调节LOC103694972/miR-29c-3p 改善TGF-β1 诱导的NRK-49F 细胞纤维化。

锁定的核酸-anti-miR-150 通过调节细胞因子信号1/Janus 激酶/信号转换器和转录激活因子通路的抑制因子，拮抗人肾小管细胞的促纤维化通路[37]。lncRNA NR_038323 过表达可以改善高糖诱导的胶原Ⅰ、胶原Ⅳ和纤维连接蛋白的表达水平，而lncRNA NR_038323 敲低则起到相反的作用[38]。 双氢青蒿素通过调节lncRNA MALAT1/miR-145/FAK 通路影响TGF-β1 诱导的肾纤维化[39]。 本研究发现过表达LOC103694972 促进温阳振衰颗粒含药血清干预下TGF-β1 诱导NRK-49F 细胞的活力，以及α-SMA 蛋白、Collagen Ⅰ蛋白。 而沉默LOC103694972 具有相反的效果。 因此，温阳振衰颗粒含药血清通过调控LOC103694972/miR-29c-3p 改 善TGF-β1 诱 导 的NRK-49F 细胞纤维化。但具体的体内效果仍需动物实验进一步验证，这也是本研究的不足之处。 本研究为温阳振衰颗粒改善肾纤维化提供了基础的理论依据，值得进一步深入探究。

此外，目前有研究证实Sp1（一个转录因子）通过直接结合lncRNA Gm26669 启动子提高其表达水平，从而促进了Collagen Ⅰ和纤维连接蛋白的表达水平[40]。lncRNA Gas5 可以靶向调节转录因子Creb5，从而调节细胞外纤维连接蛋白沉积[41]。目前，本研究只关注了LOC103694972/miR-29c-3p 在温阳振衰颗粒含药血清改善TGF-β1 诱导的NRK-49F 细胞纤维化中的表达变化，并未进一步分析相关转录因子的表达调控。 这是本研究的一个不足之处，有待进一步探索。

综上所述，本研究表明，温阳振衰颗粒改善TGF-β1 诱导NRK-49F 细胞的纤维化，其部分机制可以通过下调LOC103694972 促进miR-29c-3p 的表达。 这将为肾纤维化的治疗研究的提供一个科学依据。