王枞嵘,牛欣蕊,郭江涛,鲁维飞,刘忠虎,褚贝贝,付朋飞,王 江*

(1.河南农业大学 动物医学院,河南 郑州 450046;2.河南农业大学 农业农村部动物生化与营养重点实验室,河南 郑州 450046;3.河南农业大学 河南省动物生长发育调控重点实验室,河南 郑州 450046;4.河南城建学院 生命科学与工程学院,河南 平顶山 467036)

犬腺病毒(canine adenovirus,CAV)是哺乳动物腺病毒属中致病性最强的一种[1]。CAV根据抗原性、血凝性和致病性等特性分为犬腺病毒1型(CAV-1)和2型(CAV-2)[2-4]。CAV-1 引起犬传染性肝炎,多发于1岁以内的犬,临床症状有发热、眼鼻分泌物增多、角膜炎以及间质性肾炎等[5-6]。CAV-2在临床上主要引起犬的传染性喉气管炎、咽炎、坏死性支气管炎或肺炎等呼吸道疾病,临床常表现为高热、呼吸急促、干咳、浆液或脓性鼻漏及扁桃体肿大等,临床特征常称为“犬窝咳[7-8]”。此外也可引起出血性腹泻等消化道疾病[9-10]。CAV-2的传染性极强,传播速度快,且往往易与其他病毒或细菌混合感染,导致犬大多预后不良。

CAV-2为线型双链DNA病毒,基因组长为30～31 kb。病毒为无囊膜,二十立面体对称结构,直径为70～100 nm[11]。病毒粒子的外表面由纤突(fiber)、五邻体基质(penton base)和六邻体(hexon)衣壳组成[12]。纤突蛋白参与病毒的内化过程,在病毒侵染细胞过程中起关键作用,其介导病毒和宿主细胞受体之间的相互融合。纤突蛋白又可以分为3个基本结构功能区,包括小节、基轴和尾曲。纤突小节呈球形,具有与细胞表面上特异性受体结合的功能,及与细胞上受体结合和凝集红细胞的作用[13],另外其还与腺病毒的组织亲嗜性有关[14]。

本研究将CAV-2分离株CAV-HN45浓缩并灭活后作为抗原免疫BALB/c小鼠,经过一系列试验筛选出2株灵敏性高、特异性强的针对CAV-2 FIBER蛋白单克隆抗体,为建立快速、高效的CAV-2免疫学检测技术和基础病毒学研究提供了材料,为我国对CAV-2的防控提供了备选抗体药物。

1 材料与方法

1.1 试验材料与动物CAV-HN45株分离自河南安阳某宠物医院患病犬。SP2/0骨髓瘤细胞(本实验室保存),犬肾细胞(MDCK,ATCC),感受态细胞Top 10由本实验室制备。pEGFP-C1真核表达质粒(本实验室保存)。表达CAV-2 FIBER的pEGFP-C1-CAV FIBER真核表达质粒由本实验室构建、保存。聚偏二氟乙烯膜 (PVDF) 购自Millipore公司。HybGro杂交瘤细胞无血清培养基购自上海源培生物科技股份有限公司。β-丙内酯购自Solarbio公司。佐剂Quick Antibody-Mouse 5W购自北京博奥龙免疫技术有限公司。HAT/HT培养基、融合剂PEG1450、商业化β-actin鼠源单克隆抗体等均购自Sigma公司。Alexa FluorTM488 goat anti-mouse IgG(H+L)、Alexa FluorTM555 goat anti-mouse IgG(H+L)购自Thermo Fisher Scientific。HRP标记山羊抗小鼠IgG购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。AEC酶底物试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。蛋白质Marker购自Thermo Fisher公司。ProteinIso®Protein G Resin购自北京全式金生物技术有限公司。IgG抗体亚类鉴定试剂盒购自Si-no Biological公司。清洁级BALB/c小鼠购自郑州大学第一附属医院。

1.2 CAV-HN45株的增殖与纯化将MDCK细胞传代于T75细胞培养瓶中,培养过夜。接种CAV-HN45株病毒液0.5 mL,24～36 h待出现90% 细胞病变后,冻融3次收毒,8 000 r/min离心10 min收集细胞上清,取上清通过蔗糖密度梯度离心法浓缩纯化病毒,于-80℃保存备用。

1.3 CAV-HN45株病毒灭活与小鼠免疫取CAV-HN45株浓缩病毒液,加入β-丙内酯(终含量为0.2%)混匀后置4℃灭活48 h,将佐剂Quick Antibody-Mouse 5W与浓缩灭活病毒液等比例配制混匀,免疫病毒剂量为5 μg/只(免疫小鼠体质量为25～30 g),腿部肌肉注射免疫7周龄雌性BALB/c小鼠,首免3周后加强免疫1次,免疫剂量及方式同首免;首免5周后,取小鼠尾静脉血,通过ELISA方法检测血清抗体水平[15]。

1.4 细胞融合取抗体水平最高的小鼠处死并收集血清,无菌环境下取小鼠脾细胞与SP2/0细胞按10∶1的比例进行混合,离心弃上清。向细胞沉淀中以1 mL/min的速度滴加37℃预热的PEG-1450 1 mL,37℃作用90 s进行融合,加入14 mL 37℃ 预热的DMEM(边加边摇),37℃水浴5 min后,缓慢补加37℃ 预热的DMEM至40 mL,终止融合。离心后弃上清,加适量的37℃ 预热的加HAT的杂交瘤培养基混匀后铺96孔板进行培养[16]。

1.5 单克隆抗体筛选

1.5.1IPMA试验筛选分泌CAV-2单克隆抗体的杂交瘤细胞系 96孔板中铺MDCK,接CAV-2病毒液约18 h,用预冷含3% H2O2的甲醇室温固定15 min。PBST洗2次,5% 脱脂奶37℃ 封闭2 h。弃封闭液,PBST洗3次,加入融合细胞上清作为一抗,37℃ 孵育2 h;弃一抗,PBST洗3次,加入1∶1 000 稀释的HRP标记山羊抗小鼠IgG 二抗,37℃ 作用1 h。弃二抗,PBST洗3次,加入AEC显色液室温作用10～15 min,加入双蒸水终止显色反应,于显微镜下观察,筛选出分泌CAV-2抗体的杂交瘤细胞系。

1.5.2IFA试验筛选分泌CAV-2 FIBER蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系 将表达CAV-2 FIBER蛋白的真核重组质粒pEGFP-C1-CAV FIBER转染至MDCK细胞中,24 h后用预冷的4%多聚甲醛于室温下固定细胞30 min,1×PBS洗涤3次;用0.1% TritonX-100于室温通透细胞膜10 min,1×PBS洗涤3次;使用含10%胎牛血清的1×PBS于室温下封闭1 h,1×PBS洗涤3次;将制备的CAV单克隆抗体或杂交瘤细胞上清作为一抗与固定的细胞于37℃ 孵育1 h,1×PBS洗涤3次,加入1∶1 000稀释后的Alexa FluorTM555标记的山羊抗小鼠IgG(H+L)作为二抗,于37℃ 避光孵育1 h后,1×PBS洗3次;加入DAPI染色试剂于室温避光孵育10 min,1×PBS洗涤3次、双蒸水洗涤3次;加入封片剂封片后置于荧光显微镜下观察、分析并采集图像。在1.5.1筛选结果的基础上,用上述IFA试验进一步筛选出分泌CAV-2 FIBER蛋白抗体的杂交瘤细胞,利用有限稀释法进行亚克隆,直至得到能稳定的分泌CAV-2 FIBER蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系。

1.6 腹水的制备及抗体纯化取10～12周龄的BALB/c雌鼠,注射0.3 mL不完全弗氏佐剂。1周后,腹腔注射状态良好的单克隆细胞2.5×106个/只,待小鼠腹部明显隆起且按压有波动感时收集腹水,将收集的腹水10 000 r/min 离心10 min,取上清进行初步纯化。后将初步纯化的腹水经硫酸铵沉淀法和ProteinIso®Protein G Resin进行纯化,加甘油(最终浓度为25%～50%)将纯化后的抗体质量浓度定至1 g/L,-20℃ 保存,并用SDS-PAGE凝胶电泳进行鉴定。

1.7 单克隆抗体生物学特性分析单克隆细胞染色体数目分析:将对数生长期的单克隆细胞和SP2/0细胞中加入0.3 g/L的秋水仙素液后,37℃、5% CO2培养6 h,离心收集细胞,低渗处理、固定制片、吉姆萨染色、镜检并拍照进行染色体数目计数分析。单克隆细胞分泌抗体的稳定性分析:将筛选出的单克隆细胞连续传代培养3个月,用IPMA和IFA检测细胞培养液中抗体水平。单克隆抗体亚型鉴定:按照Sino Bioligical小鼠单克隆亚类鉴定试剂盒说明书操作,鉴定CAV FIBER单克隆抗体亚类。

1.8 单克隆抗体间接免疫荧光试验(IFA)效价测定取1.6步骤中纯化腹水所得抗体,采用固定病毒-稀释抗体法(β法)[17],以2倍倍比稀释的单克隆抗体为一抗,1∶1 000 稀释的Alexa FluorTM488 goat anti-mouse IgG(H+L)为二抗,对纯化后的抗体进行IFA抗体效价测定。

1.9 单克隆抗体体外中和试验(VNT)及抗体中和效价检测采用终点法(β法)测定抗体中和效价,通过病毒回归试验,测得病毒感染工作浓度。在96孔板内,将系列稀释的100 μL抗体 1-A12-C6、8-A12-B10与200 TCID50/100 μL的CAV病毒液等体积混匀,37℃、5% CO2培养箱孵育2 h。随后接种MDCK细胞,100 μL/孔,同时设置MDCK细胞空白对照、病毒工作浓度(100 TCID50/100 μL)感染对照和仅接种2 种抗体作用的抗体对照, 37℃ 孵育2 h后,用1×PBS洗涤1次,随即加入含1% 胎牛血清的DMEM培养基进行培养,3 d后在倒置显微镜下观察细胞病变情况(CPE)。

2 结果

2.1 免疫小鼠血清抗体水平通过ELISA方法检测免疫小鼠血清的抗体效价,免疫的4只小鼠均能分泌CAV抗体,其中3号小鼠抗体效价最高,为1∶102 400(图1),取3号小鼠进行加强免疫。

2.2 CAV FIBER蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立取加强免疫后的3号小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,经HAT培养基筛选6 d后,明显观察到融合成功的细胞增殖(图2),经IPMA和IFA对多株融合细胞进行筛选,最终获得2株分泌CAV FIBER蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为1-A12-C6和8-A12-B10。IPMA结果显示,制备的单克隆抗体可有效检测CAV感染的MDCK细胞(图3)。IFA结果显示,上述2株杂交瘤细胞所分泌的抗体与感染CAV的MDCK细胞呈现特异性免疫反应,荧光显微镜下可见红色荧光;且与转染pEGFP-C1-CAV-FIBER质粒的MDCK细胞呈现特异性免疫反应,荧光显微镜下可见细胞内EGPF-FIBER的绿色荧光与抗原抗体结合的特异性红色荧光共定位,表明该单克隆抗体可特异性检测CAV FIBER蛋白(图4)。

图1 间接ELISA检测首免35 d后小鼠血清中CAV抗体分泌水平

A.融合后2 d;B.融合后4 d;C.融合后6 d

A.1-A12-C6检测CAV感染的MDCK细胞;B.8-A12-B10检测CAV感染的MDCK细胞;C.阴性对照(SP2/0细胞上清为一抗组)

2.3 CAV FIBER蛋白单克隆抗体纯化效果经SDS-PAGE凝胶电泳鉴定(图5),纯化后的抗体在大小约50,25 kDa处有2条明显的蛋白条带,分别为抗体的重链和轻链,而未见其他杂条带。

2.4 单克隆抗体生物学特性分析对筛选出的杂交瘤细胞株染色体数目进行计数分析(图6),平均染色体数目约为106条。利用抗体亚型鉴定试剂盒检测显示(图7,表1),1-A12-C6为IgG2a型抗体,8-A12-B10为IgG2b型抗体。

A,D.SP2/0细胞上清为一抗的对照组;B,E.1-A12-C6 分泌抗体作为一抗;C,F.8-A12-B10分泌抗体作为一抗

M.蛋白质Marker;1.1-A12-C6纯化前小鼠腹水;2.1-A12-C6小鼠腹水纯化后抗体;3.8-A12-B10纯化前小鼠腹水;4.8-A12-B10小鼠腹水纯化后抗体

2.5 单克隆抗体的IFA效价测定将纯化后的抗体用1×PBS进行2倍系列稀释,作为一抗检测感染CAV的细胞。结果显示(图8,表2),2株所纯化抗体的IFA效价为1-A12-C6:1∶8 192;8-A12-B10:1∶2 048。

2.6 单克隆抗体中和活性及中和效价FIBER 蛋白位于CAV-2 病毒表面,在介导病毒感染中起重要作用。中和试验结果显示(图9,表3),不进行任何抗体处理的CAV-2感染细胞组中可看到明显的细胞病变,而抗体处理的CAV-2 感染细胞组中1-A12-C6、8-A12-B10分别最高可在1∶256,1∶64 稀释倍数下有效阻断CAV-2 感染,细胞未病变。另外,抗体处理的正常细胞组中,细胞形态正常,说明抗体对细胞不产生毒性。

A.SP2/0 细胞染色体数目;B.1-A12-C6 杂交瘤细胞染色体数目;C.8-A12-B10 杂交瘤细胞染色体数目

A.单克隆抗体1-A12-C6的亚类鉴定(1～3.1-A12-C6杂交瘤细胞上清;4.阳性对照;5.阴性对照);B.单克隆抗体8-A12-B10的亚类鉴定(6～8.8-A12-B10杂交瘤细胞上清;9.阳性对照;10.阴性对照)

表1 抗体亚型鉴定

表2 抗体免疫荧光效价

A.单克隆抗体1-A12-C6 免疫荧光阳性反应;B.单克隆抗体8-A12-B10 免疫荧光阳性反应;C.阴性反应

3 讨论

CAV在全世界流行,能在多种哺乳动物中传染,且传染速度快,易发生群体感染[18-21]。CAV-2可引起犬科动物的传染性支气管炎、传染性喉气管炎、肠炎,往往与其他呼吸道病毒混合感染,混合感染时有较严重的临床症状出现[22]。4月龄以下的幼犬易感染发病,主要通过唾液和粪便传播,可在幼犬相互舔舐的过程中使全窝或者全群犬被感染,出现咳嗽症状,“窝咳”[23]。CAV-2 FIBER蛋白为病毒的纤突蛋白,相对分子质量约为62 kDa,在腺病毒侵染过程中起关键作用,该蛋白介导了病毒与宿主细胞受体之间的相互结合[24]。纤突蛋白不仅具有型和亚群特异性抗原决定簇,还与腺病毒不同血清型的抗原特异性相关[25-28]。

A.MDCK空白细胞对照组;B.病毒工作浓度感染对照组;C.1-A12-C6抗体处理正常细胞组;D.256倍稀释1-A12-C6抗体处理病毒感染细胞组;E.8-A12-B10抗体处理正常细胞组;F.64倍稀释8-A12-B10抗体处理病毒感染细胞组

目前临床上没有治疗CAV-2的特效药物及高免血清,因此针对该病一般采用对症疗法[29]。CAV-2患病犬在康复后,虽无临床症状但体内仍可携带病毒6～9个月,这也导致该病在犬场长期传播而不能被清除。国内预防CAV-2完全依赖国外进口的商品化疫苗,不能有效针对我国不断进化的流行毒株,临床上仍可见免疫后犬感染CAV出现毒力反强的情况[30-31]。常规的治疗及疫苗接种无法有效地阻断该病的传播,防控该病需要坚持经常性的检疫。因此快速准确的做出诊断在防控CAV中十分重要。但目前我国尚无标准化、商品化的CAV阳性血清及抗体供应[32]。临床中商品化的敏感性强的快速检测试纸条不仅被国外产品垄断,而且检测的敏感性差[29]。

本研究以CAV-2免疫小鼠制备了2株抗CAV-2 FIBER蛋白的单克隆抗体。IPMA和IFA结果表明,单克隆抗体能特异性识别CAV-2病毒及CAV-2FIBER蛋白。中和活性检测试验表明,单克隆抗体对CAV-2具有中和活性,中和效价不低于1∶64。为CAV-2的检测、FIBER蛋白的功能研究、临床诊断试剂盒的开发以及相关疾病的治疗等具有重要意义。

表3 单克隆抗体病毒中和效价