胡清霞,李 颖,张琰杰,吕 妮,李 鹏,杨增岐,王兴龙*

(1.西北农林科技大学动物医学院,陕西杨凌 712100;2.农业农村部反刍动物重大疫病 防控重点实验室(西部),陕西杨凌 712100;3.陕西省铜川市新区坡头街道办事处,陕西铜川 727000)

动物疫病病原菌检测方法主要有传统鉴别方法和分子生物学方法等,聚合酶链反应(PCR)以其特异、灵敏、便捷等优点被广泛应用于各类疾病诊断[1]。但是目前PCR以及后来发展的荧光定量PCR、数字PCR等技术在动物疫病诊断中存在着依赖昂贵仪器设备、专业人员及检测时间长等局限,不适合疾病暴发时现场快速检测。近几年来,恒温核酸扩增技术解决了以上问题,其中重组酶聚合酶扩增(RPA)技术可在25～42℃条件下进行快速核酸扩增,无需控温设备,操作简单,且其特异性、灵敏度与PCR相当甚至高于PCR[2]。被认为是最可能替代PCR的检测技术,做到真正走出实验室,在资源匮乏的偏远地区实现现场快速检测。

1 RPA反应原理

1.1 反应原理

RPA反应是以T4噬菌体复制为主要反应机理,主要依赖单链DNA结合蛋白(SSB),能结合单链核酸的重组酶(UvsX)和链置换DNA聚合酶[3]。反应体系包括引物、模板DNA、ATP、醋酸镁、水、聚乙二醇、UvsY蛋白(T4噬菌体重组调节蛋白)、二硫苏糖醇及Mg2+等。重组酶在ATP、UvsY蛋白的参与下与引物结合形成蛋白-DNA复合物,再在双链DNA中寻找同源序列后,复合物插入双链DNA形成D-环结构。D环的一侧是双链,其中引物与模板链杂交,启动链交换反应,而D环的另一侧与单链DNA蛋白结合[4]。重组酶从复合物中水解出来,引物在链置换DNA聚合酶作用下从3′端开始延伸,对模板上的目标区域进行扩增,新生成的DNA链被用于另一轮RPA。……